分子诊断技术平台的建立及其在呼吸道病毒与登革病毒检测中的应用

发布时间：2017-11-05 08:12

  本文关键词：分子诊断技术平台的建立及其在呼吸道病毒与登革病毒检测中的应用

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【摘要】：目的1整合以核酸扩增为原理的各种PCR技术(普通PCR、荧光定量PCR、多重PCR)和高通量基因测序技术,建立既能快速筛查常见病毒,又有能力发现新发病毒的临床病毒检测体系,满足医疗机构用于常规检验工作和公共卫生单位应对突发性公共卫生事件的需求。2建立常见呼吸道病毒筛查的多重PCR、病毒宏基因组学高通量基因测序平台、腺病毒核酸通用及分型PCR检测体系,探讨其在呼吸系统感染病原学诊断上的应用。3基于2014年广州发生的严重登革热疫情,自主建立登革病毒核酸检测及分型技术体系,分析本次疫情流行的登革病毒型别和基因进化特征、住院患者的临床表现和实验室检测结果,以了解本次疫情的流行病学特征；比较分子诊断技术和免疫学技术在登革热临床诊断中的应用效果,以指导临床合理选择检验项目。方法1呼吸道病毒分子诊断平台的建立及应用1.1呼吸道病毒多重PCR检测体系的建立及儿童急性鼻窦炎病毒谱的研究设计一套针对A型流感病毒(Influenza A, IFA)、B型流感病毒(Influenza B, IFB)、1-4型人副流感病毒(Human parainfluenza virus, HPIV),呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial virus, RSV),腺病毒(Adenovirus, ADV),鼻病毒(Rhinovirus, RV),肠道病毒(Enterovirus, EV),人偏肺病毒(Human metapneumovirus, HMPV),人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV),冠状病毒OC43(Coronavirus OC43),冠状病毒NL63 (CoronavirusNL63),冠状病毒229E(Coronavirus 229E)共15种常见呼吸道病毒的多重PCR检测体系,对259份儿科门诊急性鼻窦炎(Acute rhino sinusitis, ARS)患儿、219份急性上呼吸道感染(Acute upper respiratory tract infection, AURI)患儿、86份对照儿童鼻拭子标本进行呼吸道病毒检测。比较分析ARS组和AURI组患儿鼻部的呼吸道病毒分布情况,分析与急性鼻窦炎的相关性最高的病毒。统计学分析采用卡方检验。1.2呼吸道宏基因组高通量测序方法的建立及儿童重症肺炎病原学的研究建立基于Ion Torrent/Proton平台的呼吸道宏基因组高通量测序技术,并对9份重症肺炎患儿肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)标本进行宏基因组测序。获得的测序读长用BLASTn与GeneBank数据库中的基因组序列进行比对,分析标本中存在的病毒种类及丰度,对标本中微生物的种类进行定性与定量检测。数据量足够时使用Trinity软件组装病毒的全基因组序列,使用TVC和GATK两种方法进行SNPs及InDel突变的检测,使用BioEdit7.0和MEGA6.0软件进一步做毒株的同源进化分析。并比较NGS技术与PCR扩增和传统培养鉴定结果的一致性。1.3腺病毒通用及分型PCR检测方法的建立及各亚型流行特征的研究设计针对腺病毒Hexon基因保守区的通用引物、探针以及3、4、7、14、21型腺病毒型特异性引物,建立人腺病毒检测及分型的普通PCR和荧光定量PCR方法,对105份腺病毒核酸检测阳性的儿童呼吸道感染标本进行基因分型,分析腺病毒各亚型在儿童呼吸道感染疾病中的分布情况。2登革热分子诊断技术的建立及评估2.1登革病毒PCR检测体系的建立及广州登革疫情的流行病学研究设计1-4型登革病毒通用及型特异性的普通PCR和荧光定量PCR引物、探针,建立登革病毒核酸检测及分型体系。并对2014年9月20日至2014年11年20日间于广州医科大学附属第一医院确诊的登革热住院患者的血清标本进行登革病毒检测及分型,对病毒分离株的E、NS 1基因序列做进化分析,开展登革病毒分子流行病学研究。2.2登革热分子诊断与免疫学检验方法的比较根据WHO诊断标准,收集138名登革热确诊住院患者的254份血清样本,并进行病毒核酸(荧光定量PCR技术)和登革病毒NS1抗原(ELISA).特异性抗体(层析免疫分析法)检测。对诊断登革热的分子生物学与免疫学方法进行比较,观察不同检测指标在病程中的变化规律,为合理使用登革热实验室诊断项目提供依据。2.32014年广州登革热住院患者临床特征与检验结果的分析收集138名登革热住院患者的临床资料,按照其感染的登革病毒血清型、发病程度(普通或重症登革热)进行分组,比较不同组间皮疹、肌肉痛、恶心呕吐、腹痛腹泻等症状,白细胞、血小板、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等多项临床检验指标的差异及其在发病期间的动态变化规律。成果1呼吸道病毒分子诊断整合平台的建立及应用1.1呼吸道病毒多重PCR检测体系的建立及儿童急性鼻窦炎病毒谱的研究使用呼吸道多重PCR筛查体系从564份鼻拭子标本中检出179株(31.7%)病毒,ARS组(44.4%)、AURI组(27.4%)和对照组(4.7%)各组之间病毒检出率的差异有统计学意义(P0.001,RR=2.116,95%CI=1.440～3.110)。RV的检出率最高,在ARS组中有24例(9.3%),AURI组中9例(4.1%),差异有统计学意义(P0.05,RR=2.27)；另外ARS组检出腺病毒16例(6.2%),AURI组4例(1.6%)(P0.05,RR=3.374),其余病毒在两组之间的检出率无统计学差异。1.2呼吸道宏基因组高通量基因测序方法的建立及儿童重症肺炎病原学的研究成功利用呼吸道宏基因组高通量测序技术对重症肺炎患者BALF标本进行病原检测,结果显示每份标本中病毒、真菌、细菌的读长序列所占比例各不相同。检测出的主要病原体有7例ADV-7,其中一例是ADV-7和HPIV混合感染,MPV和H3N2甲型流感病毒各1例,同时共存有多种低丰度的其他病毒,如RSV, TT病毒,HPV, EBV,沙门达病毒。通过拼接与组装获得了4例7型ADV型病毒全基因组序列,相互之间相似度99.7%,且与近年来我国各地报道的7型腺病毒序列均高度相似(98.1%)。PCR扩增结果为7例ADV、MPV和A型流感病毒各1例,与宏基因组测序结果基本一致,但漏检了混合感染中的HPIVo宏基因测序检测结果除去大量正常菌群外,检出副流感嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、黏液罗斯菌、大肠杆菌等；检出2例肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae,MP)和1例热带假丝酵母菌,与培养鉴定结果基本相同,但宏基因测序可获得的细菌种类更全面,易发现两种或两种以上细菌混合感染。而在真菌鉴定方面,宏基因测序漏检了1例白色假丝酵母菌,培养鉴定方法则误将热带假丝酵母菌鉴定为酿酒酵母。1.3腺病毒通用及分型PCR检测方法的建立及各亚型流行特征的研究本节设计的ADV通用PCR引物及探针,型特异性分型引物均能扩增特异性产物,不同型之间无交叉反应。105份阳性核酸标本使用荧光定量PCR检测均为阳性,而普通PCR只能检测出87例(82.9%)。使用分型PCR对80份标本进行了腺病毒分型,其中ADV-3型检出率最高共有50例(57.5%)、其次ADV-7型23例(26.4%)、ADV4型5例(5.7%)、ADV14型和21型各1例,分别占1.1%。但重症肺炎患者中ADV-7型(66.7%)的检出率高于ADV-3型(33.3%)。2登革热分子诊断技术的建立及评估2.1登革病毒PCR检测体系的建立及广州登革疫情的流行病学研究本实验最终纳入了138名登革热住院患者,其中124例(89.9%)核酸检测阳性,DENV-1型107例(77.5%),DENV-2型17例(12.3%)。流行病毒株的E、NS1基因进化分析结果表明DENV-1和DENV-2毒株都与广东省2006至2013年间流行的病毒株高度相似(99%)。2.2登革热分子诊断与免疫学检验方法的比较以首次发热时间为病程第一天,vRNA核酸检测阳性率在前五天均为100%,七天内可维持在80%以上。NSl抗原检测的阳性率在第三至第九天持续维持在90%以上。IgM抗体在第六日开始升高至80%；IgG抗体前8天阳性率在20%以下,后续可稳定保持在80%以上。vRNA与NS1抗原检测在八天内的联合诊断率达到100%；NS1抗原和抗体检测在第七至十天的联合诊断率为100%。2.3广州登革热住院患者临床特征与检验结果的分析所有登革热患者均会出现高热,其中约52.2%的患者出现肌肉、骨关节疼痛,31.2%出现明显皮疹,(20～30)%的患者伴有不同程度的消化道症状,如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等；病情严重者常出现意识障碍,多器官功能障碍,甚至休克、死亡。白细胞和血小板计数都有明显降低趋势,白细胞均值在第五天降至最低值(2.85±1.6)/L,血小板均值在第七天左右到达最低(78±51.8)/L,ALT、AST、CK、LDH、D-Dimer在感染期间有升高趋势,大部分患者的血Bun、Cr水平在感染期间无明显变化。1、2型登革病毒感染患者的各项临床症状的发生率与检验结果均无统计学差异。而8例(5.8%)重症登革热患者中有6人(75%)出现意识障碍,2人(25%)出现休克,2入(25%)死亡。重症登革热组的平均住院时间(18.6+9.5天)及实验室检验结果包括：PLT(29.6±27.2)/L、 ALT(138.3±164.6) U/L、AST(179.5±117.5)U/L、CK(1969.6±3821.5)U/L、 LDH(2743.3±6148.4)U/L、D-Dimer(5113.7±3962.9)ng/ml、Cr(276.4±426.6)umol/L、 BUN(10.0±7.5)mmol/L与普通登革热患者组的结果相比均有显著的统计学差异。结论：1呼吸道病毒分子检测体系的建立与应用研究本课题建立了中低通量的呼吸道病毒多重PCR筛查体系,能经济、快速的扩增15种常见的呼吸道病毒,不仅可以满足临床常规检测的需要,更是应对突发传染病快速筛查病原体的重要工具,当常规检测无法找到明确的病原体时,我们建立的宏基因组测序方法将以其不依赖特异性扩增的技术特点,及时检测出新发、再现的或者发生明显变异的病毒,同时还能获得标本中所有微生物种类及相对含量、从原位标本中获得病毒全基因组序列及毒株突变位点的信息,在临床病毒的诊断、研究,急性突发性传染病的检测和监控等方面都用重要的应用前景。本课题应用该检测体系发现感染呼吸道病毒会增加儿童患鼻窦炎的几率,其中RV和ADV与儿童急性鼻窦炎的发病关系最紧密。儿童重症肺炎病原学的研究结果显示,ADV-7型是主要的病原体,并且易引起细菌、真菌或MP的混合感染,ADV-7基因序列保守,本次获得的四株7型腺病毒高度相似,结合我国多地的病例报道,提示ADV-7引起的重症感染在我国多地散发。但是,通过自主建立的腺病毒通用及分型PCR核酸检测体系对各亚型腺病毒的流行特点的分析,发现广州地区腺病毒的流行主要以3型为主,但在重症肺炎病例中ADV-7型的阳性率明显高于3型。7型腺病毒在下呼吸道的致病性可能高于上呼吸道,是引起儿童重症肺炎极为重要和关心的病原体,但其关键性的致病因素尚未研究清楚。2登革热分子诊断技术的建立及评估本课题初步建立了登革病毒PCR及荧光定量PCR通用检测及分型体系,通过核酸分型检测以及对E、NS1基因序列的进化分析,发现此次疫情共有两型登革病毒(DENV-1,DENV-2)流行,两种血清型的毒株都与广东省近年来的多株病毒十分接近。经过多年散发流行和输入病例的积累,广东可能已经形成了DENV-1, DENV-2的地方性传播。2014年广州登革疫情中由1、2型DENV感染的病例在临床表现上无差异,而重症登革热患者相较普通患者血小板降低更加显著,出现明显的心、肝、肾、中枢神经系统功能损伤,需要更长时间进行住院治疗,各种检验结果对登革热患者病情程度的判断有重要作用,可帮助患者及时获得对症治疗,降低病死率。核酸检测是登革热早期诊断最佳的方法。NSl在早期的灵敏度略低于核酸检测,但持续的时间较长。而抗体检测则在病程后期有重要的诊断作用。以患者首次发热作为病程第一天,八天内建议采用核酸检测结合NSl抗原检测,第七至十天推荐选择NS1抗原结合抗体筛查,十天之后则应以抗体筛查为主,合理选择检验项目将直接影响诊断的准确性。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;R512.8

【参考文献】

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1 郭鹏娟;甘标;詹希美;;登革热实验室诊断研究进展[J];中国公共卫生管理;2013年05期

2 林立;李昌崇;;“儿童社区获得性肺炎管理指南(2013修订)”解读[J];中华妇幼临床医学杂志(电子版);2014年06期

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本文编号：1143332