抗华支睾吸虫亲环素A抗体对急慢性炎症损伤的保护作用

发布时间：2017-11-22 14:11

  本文关键词：抗华支睾吸虫亲环素A抗体对急慢性炎症损伤的保护作用

  更多相关文章： 华支睾吸虫 亲环素A 脓毒症 胰岛β细胞 抗体

【摘要】：研究背景:免疫系统,是多细胞生物体,特别是哺乳动物保护自身组织器官健康、维持内环境稳定的重要防御系统。各种炎症细胞通过细胞因子、化学介质及细胞接触介导的信号交流,实现统一的调控与调配。正常的免疫系统经由大量的正向和反向的调控过程维持其相对平衡状态,免疫功能不足和过度或免疫调节的失衡,都会导致疾病发生。炎症是机体在组织损伤和感染时所表现出来的一种免疫学过程,适度的暂时的炎症反应能帮助机体抵抗感染,促进组织修复;过度的和慢性的炎症导致疾病的进展恶化并诱发多种慢性病。过炎症反应性疾病(如感染所致的脓毒症),局部的炎症病变扩展为系统性炎症反应综合症(SIRS),继而引发多器官功能衰竭(MODS),最终导致患者死亡。多种体内和环境的理化因素、衰老、氧化应激等可刺激机体产生轻中度的慢性炎症引起细胞损伤与凋亡,甚至持续激活机体炎症细胞,引起多个组织器官系统的代谢和功能异常,使机体呈现持续高消耗状态,造成营养不良,引起多种慢性疾病,如高血压、糖尿病、冠心病、肝纤维化、慢性肾炎、肿瘤、老年性痴呆等。可以说,不可控炎症和慢性炎症反应是几乎所有重症感染性疾病和慢性病的病理生理学基础。有效地调控炎症反应过程使其恢复平衡状态是防治疾病的关键。目前对炎症反应性疾病的干预,几乎都是针对病灶部位的特定的终末炎症细胞和介质进行调控。由于不同器官系统病理生理过程的异质性,临床相应采用的各种抗炎症治疗方案基本上都是末端调控,治标不治本,往往是短时间内缓解,反复发作。不同组织器官、不同类型的炎症反应,有没有共同的病理生理学分子机制?如果能找到上游的共同的炎症反应始动因素,就能从源头上干预炎症反应过程,有效预防和控制各类急慢性炎症反应性疾病,实现“治本”的目标。我们通过对大量文献的阅读,试图寻找出担当这一角色的分子。我们发现一个不太引人关注的多功能蛋白亲环素A(Cyclophilin A,CyPA)具有这样的潜力。CyPA是一种在多种生物学过程中发挥重要作用的蛋白,属于一个保守的管家基因家族亲免素的成员,广泛存在于部分原核及所有真核生物细胞内,不同物种间的CyPA的氨基酸序列有高度的同源性。CyPA分子具有两个相对独立的功能域,分别承担肽酰-脯氨酸顺反异构酶(PPIase)活性和核酸酶活性。通常情况下,CyPA主要存在于细胞内,是细胞内含量最丰富的蛋白之一,约占胞质中蛋白分子总数的1%,主要发挥分子伴侣的作用,通过其PPIase酶活性,参与细胞内多种蛋白的构象改变和功能的调节,以促进新生肽链的正确折叠,也参与了一些病毒的感染和细胞内复制。CyPA同时具有非经典途径分泌信号,当细胞处于氧化应激状态下,细胞内的CyPA经由非经典途径释放到细胞外。细胞外的CyPA通过其PPIase酶活性中心识别存在于内皮细胞及炎症细胞表面的CD147受体上的脯氨酸残基,改变受体分子的构象,激活相应的信号通路,可促进血管内皮细胞凋亡,提高血管通透性,利于局部炎症细胞渗出浸润。因此CyPA是一种重要的炎症细胞和一些淋巴细胞的趋化因子,募集这些免疫细胞到达损伤部位,促进局部炎症反应。细胞的损伤和破坏,也使得细胞内大量的CyPA释放出来,参与炎症反应过程。由于CyPA分布广泛,其在炎症中的作用主要涉及早期的诱导与炎症的引发。大量研究文献证实:肿瘤、病毒感染、糖尿病、脓毒症、自身免疫系统疾病等都伴有CyPA的高表达和分泌。寄生虫是单细胞或多细胞的真核生物,与宿主构成一种特殊的共生关系。寄生虫一方面通过虫体移行对宿主造成机械损伤,或通过其分泌的蛋白或代谢排泄产物的化学损伤,引起宿主的炎症反应,即寄生虫病;另一方面,寄生虫也能对宿主的免疫系统进行调节,降低宿主对虫体的免疫攻击力,产生免疫逃避得以生存和发育,完成其生活史过程。寄生虫感染对宿主的免疫调节作用,势必会影响机体对其他刺激的炎症反应过程。在发达国家,由于其经济水平、生活水平及环境水平的提高,人群寄生虫感染率已降到很低的水平。然而,大数据流行病学研究发现,随着寄生虫病的日益减少,人群免疫系统疾病、糖尿病、重症感染等疾病的发病率不断上升,人群总体健康水平并没有因此得到提高。因此,经典的寄生虫与宿主的关系的概念面临着新的挑战。我们从人体生态系统的视角和自然辨证法的高度,提出了对寄生关系新的理解,即是寄生虫和宿主之间是一种互有利害的妥协的共生关系。寄生虫在给宿主造成一定程度的损伤的同时,也赋予了宿主更强大的的免疫平衡和调节能力。寄生虫与宿主在长期共同进化过程中,某些彼此密切作用的蛋白分子出现了趋同进化的现象,在结构和功能方面变得更加相似,以降低寄生虫蛋白的免疫原性,提高免疫相容性,实现免疫逃避的目的。此外,一些参与疾病过程的寄生虫和宿主直系同源蛋白之间的高相似性也赋予了它们之间的免疫交叉反应性,宿主针对寄生虫蛋白的抗体会通过免疫交叉反应中和或抑制内源性同源蛋白的致病作用。正是基于这种认识,本实验室在之前研究中,从华支睾吸虫分泌排泄抗原中鉴定出与宿主CyPA高度同源的华支睾吸虫亲还素A(Clonorchis sinensis Cyclophilin A,Cs CyPA)。研究证实Cs CyPA免疫宿主可以产生相应的抗体,并且和宿主的CyPA有免疫交叉反应性。宿主的CyPA与这种抗体结合后,对宿主CyPA所介导的急性及慢性炎症反应是否能产生保护作用是本论文要研究和阐述的主要问题。研究目的:通过建立脓毒症模型及胰岛β细胞损伤模型,阐述CyPA在急慢性炎症反应中发挥的作用,并观察抗Cs CyPA抗体可否对机体有保护作用,从而理解寄生虫药物对人体疾病预防和治疗的重要性。研究方法:1.CyPA生物信息学分析及同源性比较自Genebank中下载4个物种CyPA的序列,对比其相似度。用Motif Scan软件预测其PPIase酶活性位点。采用BLAST进行序列及酶活性区域比对。2.不同物种重组CyPA(r CyPA)与抗r Cs CyPA抗体的免疫反应性检测使用蛋白免疫印迹技术(Western Blot)检测抗r Cs CyPA抗体与r Cs CyPA,r Sj CyPA,r Mu CyPA和r Hs CyPA之间的免疫反应性。3.酶活性检测PPIase酶活性检测依照Fischer总结的chymotrypsin-coupledcleavage检测法进行。4.抗r Cs CyPA抗体对急性炎症反应----脓毒症的治疗作用研究4.1抗r Cs CyPA抗体制备收集r Cs CyPA蛋白免疫后SD大鼠血清,采用硫酸铵沉淀结合G-Sepharose柱法进行抗体纯化。并用BCA检测抗体蛋白浓度。4.2脓毒症小鼠模型建立采用小鼠盲肠结扎穿刺模型建立72h死亡率高达80%的急性脓毒症模型。4.3细胞因子及CyPA检测CLP手术后,6、12、24、48、72小时分别取小鼠血清使用相应的ELISA试剂盒检测TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-4,IL-10,CyPA浓度。4.4小鼠肺及肠系膜组织病理变化CLP手术后,6、12、24、48、72小时分别取小鼠肠系膜及肺组织,进行石蜡包埋切片及HE染色,而后观察病理变化。4.5凝血样本收集及指标检测小鼠血液通过抗凝管收集,所有实验必须在取样后4h内完成。凝血酶时间(PT),活化部分凝血活酶时间(a PTT)使用automated coagulometer进行检测;血小球计数使用自动血细胞计数仪进行检测,血浆D-二聚体通过D2D ELISA检测试剂盒检测。4.6血管内皮细胞分离,培养,处理小鼠血管内皮细胞分离培养按照Mika Kobayashi 2005年提出的设计方法并有所改进。提取小鼠主动脉内皮细胞,并与r Mu CyPA及抗r Cs CyPA抗体共孵育。细胞活力通过CCK-8来检测。5.抗r Cs CyPA抗体对慢性炎症反应----STZ诱导胰岛β细胞损伤的预防作用研究5.1小鼠免疫r Cs CyPA蛋白免疫C57小鼠。初次免疫,50μg蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合后于小鼠腹部皮下多点免疫。间隔10天后,25μg蛋白和等体积的弗氏不完全佐剂混合,腹部皮下多点加强免疫,共2次。每次免疫前及末次免疫1周后小鼠尾部采血。5.2 STZ高脂饮食构建胰岛β细胞损伤模型依照James Mu等所建立的药物诱导合并高脂饮食导致小鼠胰岛损伤模型。给与4周高脂饮食,一次性腹腔注射链脲霉素(streptozocin,STZ),再给予6周高脂饮食并持续观察。5.3体重及血糖指标变化持续测量体重,并用罗氏血糖仪持续监测血糖5.4口服糖耐量小鼠第10周,灌胃葡萄糖溶液(2g/kg),记录灌胃后0、30、60、90、120分钟血糖变化。5.5胰岛免疫荧光变化及细胞计数新鲜获取的胰腺组织浸泡于10%多聚甲醛中至少48h。石蜡包埋切片,采用抗胰岛素抗体和抗胰高血糖素抗体进行免疫荧光双染,被标记为红色荧光区域为胰岛α细胞,被标记为绿色荧光的区域为胰岛β细胞。Image-Pro Plus6.0进行胰岛细胞计数。5.6血清CyPA,胰岛素,炎症因子水平采用相应的ELISA试剂盒进行血清浓度检测。研究结果:1.生物信息学分析Cs CyPA与日本血吸虫、小鼠、人的CyPA的相似度分别为66%,74%和74%。Cs CyPA的PPIase酶活性区域与日本血吸虫、小鼠、人的CyPA酶活性区域的相似度分别为92%,83%和83%。2.免疫反应性r Cs CyPA,r Sj CyPA,r Mu CyPA和r Hs CyPA均可以与抗r Cs CyPA抗体结合,与PBS没有反应。结果说明华支睾吸虫、日本血吸虫、小鼠、人的CyPA蛋白与抗r Cs CyPA抗体具有相似的免疫反应性。3.酶活性及抑制r Mu CyPA蛋白具有PPIase酶活性,并且酶活性成剂量依赖性。加了抗体的反应体系酶促反应速率明显下降,并与所加入抗体的量成计量相关性。4.抗r Cs CyPA抗体对脓毒症小鼠治疗效果评价4.1生存率生存率检测在手术后72h进行。假手术组全部存活,生存率为100%。在CLP控制组,生存率为10%。在CLP治疗组,其生存率为45%。CLP控制组与CLP治疗组之间存在明显的统计学差异(p0.05)。4.2血清CyPA含量变化CLP术后,小鼠血清CyPA含量明显增加。在6、12、24、48小时,CLP控制组与假手术组CyPA含量存在明显的统计学差异(p0.05),在72h时两组的数据没有统计学意义(p0.05)。4.3炎症因子变化4.3.1促炎因子——TNF-α,IL-6,IL-1βCLP控制组小鼠手术后,血清中三种炎症因子水平都有升高。TNF-α水平术后增加,并于术后24h达到最大值。IL-6水平术后增加,并于术后12h达到最大值。IL-1β水平术后增加,并于术后12h达到最大值。与CLP控制组相比,CLP实验组在注射抗体后,小鼠血清中TNF-α,IL-6,IL-1β的水平在术后12h及24h明显降低(P0.05)。其他时间段与控制组无统计学差异(P0.05)。4.3.2抑炎因子——IL-4,IL-10CLP控制组小鼠手术后,血清中2种炎症因子水平都有升高。IL-4水平术后增加,并于术后24h达到最大值。IL-10水平术后增加,并于术后24h达到最大值。与CLP控制组相比,CLP实验组在注射抗体后,小鼠血浆中IL-4,IL-10的水平在术后无统计学差异(P0.05)。4.4肺组织及肠系膜病理变化4.4.1肺组织病理变化CLP控制组,手术后12h肺组织出现明显的较大的血栓,术后48h及72h出现明显的出血、白细胞渗出、炎症细胞聚集、肺泡壁增厚、肺泡间隙闭塞。CLP治疗组在术后24h出现了较明显的血栓。在48h及72h可见较为明显的白细胞渗出及水肿,但是无明显的出血及肺泡间隙闭塞。4.4.2肠系膜组织病理变化CLP控制组,大量的白细胞在术后6h渗出血管。术后72h可以明显观察到细胞溶解,梭形细胞和弥漫性肠系膜纤维化。在CLP治疗组中,炎性病灶受限,有些部位的脂肪细胞在病变后72h仍然保持正常形态。4.5凝血指标检测小鼠CLP模型成功的诱导了DIC。CLP控制组与假手术组相比,血小板计数,纤维蛋白原浓度,PT,a PTT,D-dimer在术后6小时都有明显变化。在血小板计数,PT,a PTT,D-dimer数据上,CLP治疗组与CLP控制组相比都有明显的改观,特别是在术后48h及72h,治疗组的DIC得到明显改善。4.6血管内皮细胞生存率检测r Mu CyPA促使细胞数量减少,蛋白对细胞数量的作用呈剂量依赖性。与10μg r Mu CyPA组相比,加入1μg和10μg抗体组能明显促进细胞生存,10μg抗体组作用最强,0.1μg抗体组没有明显统计学差异(p0.05)。5.r Cs CyPA免疫对STZ诱导胰岛β细胞损伤的保护作用5.1体重变化注射药物STZ后,PBS免疫组及r Cs CyPA免疫组开始出现体重的下降,并逐渐低于正常组小鼠。与PBS免疫组相比,r Cs CyPA免疫组小鼠体重下降较为缓慢。正常组小鼠由于未使用STZ,其体重稳步增长,并无下降趋势,并于实验第8-10周稳定于27g左右。5.2血糖指标变化正常组小鼠基本维持在9左右。STZ注射后,PBS免疫组及r Cs CyPA免疫组血糖明显降低。与PBS免疫组小鼠相比,r Cs CyPA免疫组小鼠在注射前血糖升高较慢,注射后血糖下降较慢,趋势不如PBS免疫组变化明显。5.3口服糖耐量在给予葡萄糖之后,三组小鼠血糖水平明显升高,升高幅度基本一致,继而开始下降。正常组在试验后120分钟血糖恢复正常。r Cs CyPA免疫组和PBS免疫组血糖下降均较慢。120分钟时,r Cs CyPA免疫组血糖与空腹相比尚升高14%,PBS免疫组血糖与空腹相比尚升高100%。因此r Cs CyPA免疫组胰岛β细胞状态较PBS免疫组状态好,尚有部分功能保留。5.4胰岛免疫荧光变化及细胞计数与正常组相比,PBS免疫组及r Cs CyPA免疫组在注射STZ后,胰岛中心的β细胞区域出现裂隙及红色荧光渗透,提示出现大量胰岛β细胞的坏死或凋亡。r Cs CyPA免疫组2w与正常组之间β细胞计数无统计学差异。PBS免疫组与r Cs CyPA免疫组4w、6w均有明显的区别,具有统计学差异。5.5血清CyPA水平正常小鼠血清CyPA含量很低。注射STZ之后,PBS免疫组各个时间段与正常组相比,CyPA水平都明显升高,并随时间推进逐渐增加。与之相比,r Cs CyPA免疫组CyPA含量与正常组小鼠无统计学差异。5.6血胰岛素水平PBS免疫组2w、4w、6w及r Cs CyPA免疫组4w、6w与正常组相比,胰岛素分泌减少,其结果有统计学差异(P0.05)。提示在上述时间段,两组小鼠胰岛β细胞均有较明显损伤。各个时间段相对比,r Cs CyPA免疫组与PBS免疫组均有明显的差异(P0.05),r Cs CyPA免疫组血胰岛素水平较PBS免疫组高。提示r Cs CyPA免疫组小鼠胰岛β细胞功能有一定保留抗r Cs CyPA抗体对小鼠胰岛β细胞有一定的保护。5.7血炎症因子IL-1β与TNF-α在r Cs CyPA免疫组与PBS免疫组基本相似,说明小鼠在注射STZ后成慢性炎症状态,但两组的炎症因子有统计学差异。总体来看,抗Cs CyPA抗体对于早期的慢性炎症发生有一定的抑制,可以减少炎症因子分泌,但是6w时与PBS免疫组基本无差异。结论:1.不同物种间CyPA相似度较高,抗Cs CyPA抗体可与小鼠CyPA产生免疫交叉反应,有效抑制CyPA的PPIase酶活性。2.抗Cs CyPA抗体对于小鼠脓毒症有较好的治疗作用,通过减轻炎症反应,抑制DIC,保护内皮细胞等多方面发挥保护作用,从而降低死亡率。3.Cs CyPA免疫小鼠对于STZ造成的胰岛β细胞损伤有一定的保护作用。小鼠胰岛β细胞数量及胰岛素分泌量都有一定保留,机体慢性持续炎症反应改善。
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R532.23
，

本文编号：1214955