登革病毒感染诱导A549细胞和单核巨噬细胞产生G3BP1颗粒

发布时间：2017-12-09 08:29

  本文关键词：登革病毒感染诱导A549细胞和单核巨噬细胞产生G3BP1颗粒

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【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科黄病毒属,按其免疫学特性可分为4个血清型。登革病毒通过蚊虫叮咬进入人体之后,根据临床表现的严重程度可分为登革热(dengue fever,DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)、登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。近几十年登革热发病率大幅度上升,WHO最新统计资料显示每年约有1亿人感染登革病毒,约50万感染者会发展成登革出血热,继而发展成登革休克综合征。登革病毒传播所造成的危害已成为一个主要国际公共卫生关切问题。虽然登革热的流行日趋剧烈,但迄今为止,临床上尚无特异性的抗登革病毒治疗的药物。宿主细胞在病毒感染后,可产生多种不同的应答反应,包括自噬、凋亡、固有免疫应答、应激颗粒(stress granule,SG)形成等。SG是病毒感染真核细胞后诱导细胞eIF2a磷酸化,翻译的起始受到阻滞,mRNA随后与起始因子、核糖体亚基、mRNA结合蛋白(TIA-1、G3BP、Hu R等)结合,聚集形成的细胞质RNA应激颗粒。作为宿主应对外界压力的产物,其形成在抗病毒感染中起着重要作用。目前关于SG的组分、形成以及分解的研究日趋成熟,SG与病毒之间相互作用的报道也越来越多。在应对不同病毒感染的时候,细胞形成SG的情况各异,大致可以分为以下三种:部分病毒对宿主产生的SG形成耐受,甚至利用SG的组分为其复制增殖服务,保证其持续感染宿主细胞;部分病毒感染后诱导胞内SG形成,直至感染中期,病毒利用自身产物与SG的成分相互作用,或者其他机制,局部或彻底抑制sg的形成;还有一些病毒感染细胞后,迅速阻遏胞内sg形成,宿主细胞不能检测到sg产生。已有文献报道登革病毒感染bhk-21细胞后,可抑制sg的形成。但登革病毒感染人源细胞后是否可以诱导sg形成,目前仍然不明确。为此,本研究利用两个登革病毒研究的常用人源细胞模型:肺癌上皮细胞系a549和人原代巨噬细胞,检测登革病毒感染后应激颗粒的产生情况;并初步探讨了应激颗粒形成与登革病毒复制的关系。第一部分,登革病毒诱导a549细胞形成g3bp1颗粒1.1目的检测登革病毒感染a549细胞中,应激颗粒组分蛋白g3bp1、tia-1的细胞定位;探究细胞颗粒的形成与病毒的复制水平的关系。1.2方法(1)通过免疫荧光检测法检测登革病毒感染a549细胞后,g3bp1、tia-1以及病毒蛋白prm的细胞定位情况。(2)在细胞感染denv2后,用poly(i:c)或者hipp处理诱导sg产生,通过免疫荧光检测法检测tia-1阳性细胞的比例,以及用tcid50法检测感染上清中病毒的滴度。(3)通过sirna技术沉默sg组分g3bp1,然后通过免疫荧光检测法比较g3bp1、tia-1以及病毒蛋白prm的变化;tcid50法检测感染上清中病毒的滴度。(4)通过westernblot检测denv感染的细胞中应激颗粒形成的关键起始蛋白pkr和eif2α磷酸化情况。(5)通过免疫荧光检测法检测denv感染的细胞中dsrna的变化。1.3结果(1)登革病毒感染的a549细胞中,g3bp1被招募进细胞质颗粒中。(2)sg的形成与登革病毒复制水平呈负相关。(3)sg对病毒复制具有负调节作用。(4)pkr和eif2α的磷酸化主要发生在病毒感染的后期。(5)dsrna的积累在病毒感染的中后期被检测到。1.4结论在登革病毒感染的a549细胞中,g3bp1不依赖tia-1形成颗粒;应激颗粒可以抑制登革病毒的复制;登革病毒dsrna的产生和pkr的活化发生于病毒感染的晚期,提示病毒可能通过延迟dsrna的产生和pkr的活化抑制sg的形成。第二部分,登革病毒感染单核巨噬细胞形成g3bp1颗粒2.1目的诱导外周血单个核细胞向巨噬细胞分化;检测登革病毒感染巨噬细胞后g3bp1、tia-r的细胞定位,初步分析巨噬细胞的应激颗粒的形成与病毒复制之间的相互关系。2.2方法(1)通过免疫磁珠分选人外周血cd14+单核细胞并检测分选后纯度。(2)显微镜观察cd14+单核细胞向巨噬细胞分化的形态变化。(3)通过免疫荧光检测法检测登革病毒感染巨噬细胞后,sg组分g3bp1、tiar以及病毒蛋白ns1的细胞定位。2.3结果(1)采用免疫磁珠阳性分选可以获得高纯度(85%)的cd14+细胞。(2)cd14+单核细胞诱导后贴壁牢固,体积明显增大,形状逐渐变成煎蛋状或长梭形。(3)在登革病毒感染的巨噬细胞里,G3BP1被招募进细胞质颗粒中,但TIAR不会形成颗粒。2.4结论登革病毒感染的巨噬细胞里,G3BP1可以不依赖TIAR诱导聚集成颗粒;与登革病毒感染A549细胞的结果一致。
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.8
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本文编号：1269739