以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

发布时间：2017-12-09 10:09

  本文关键词：以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

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【摘要】：在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R~2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。
【作者单位】： 昆明理工大学生命科学与技术学院云南省分子医学研究中心;
【基金】：国家科技支撑计划(2014BAI01B01)
【分类号】：R512.5;R440
【正文快照】： 表1序列分析中所用的参考株信息Table 1 Background of the reference strains insequence analysisNumber12345678910111213Gen Bank No.HQ426649EU697902FJ158600FJ765423FJ765429HQ891925HQ456310HQ668280HM212465JF918554JN256065JN835284JN579745Number14151617181920212

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本文编号：1270003