升高核糖核酸酶H活性对HIV-1逆转录酶抑制剂药效学的影响

发布时间：2017-12-21 10:23

  本文关键词：升高核糖核酸酶H活性对HIV-1逆转录酶抑制剂药效学的影响　出处：《北京协和医学院》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：逆转录(Reverse Transcription)是HIV-1生命周期重要环节,即病毒感染CD4+细胞以其自身基因组RNA为模板逆转录生成双链DNA的过程,该过程由HIV-1逆转录酶(Reverse Transcriptase, RT)催化。RT有三种酶活性：RNA依赖的DNA聚合酶(RNA Dependent DNA Polymerase, RDDP)活性,DNA依赖的DNA聚合酶(DNA Dependent DNA Polymerase, DDDP)活性和水解RNA/DNA杂交双链中模板RNA的核糖核酸酶H (Ribonuclease H, RNase H)活性,三种酶活性协调进行共同完成逆转录过程。RT是抗艾滋病药物经典靶点,目前已上市12种逆转录酶抑制剂,包括7种核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors, NRTIs)和5种非核苷类逆转录酶抑制剂(non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors, NNRTIs),均为逆转录酶DNA聚合酶抑制剂,患者长期服用后会产生耐药病毒导致治疗失败。至今临床尚无作用于逆转录酶RNase H的药物,因此对新靶点RNaseH的研究,对耐药HIV治疗有重要意义。HIV逆转录是一个复杂而有序的过程,由逆转录酶DNA聚合酶活性与RNase H活性协调催化。现有抗艾滋病治疗方法中,DNA聚合酶抑制剂是首选药物。本论文欲研究的科学问题是：若使用DNA聚合酶抑制剂的同时升高RNase H活性,加剧破坏两种酶活性平衡,是否可达到更优抗HIV效果。本论文试图通过不同方法提高RNase H活性,然后研究RNase H活性提高时NRTIs和NNRTIs单独及联合使用的药效学。考察升高RNase H活性对逆转录酶抑制剂抗HIV-1体外药效学的影响。论文尝试两种方法提高RNase H活性：寻找RNase H激动剂和高RNase H活性突变逆转录酶。首先通过文献检索和试验,试图发现可升高RNase H活性的化合物,结果未发现有RNase H激动剂报道；然后我们通过检索确认了33个用于临床的抗病毒药物,并进行了RNase H活性评价试验,亦未发现RNase H激动剂。在寻找RNase H激动剂的同时,我们还试图寻找RNase H活性升高的逆转录酶。通过查阅大量文献,尚无高RNase H活性突变逆转录酶的报道。因此,本研究将文献检索重点转向艾滋病临床病例报道,关注临床分离并测序的HIV突变毒株,最终确定了6个突变毒株,这些毒株具备如下特点：①为临床分离病毒,因此其保留了RT功能,即有DNA聚合酶活性和RNase H催化活性；②由于所确定的临床分离株不耐药,说明NNRTIs和NRTIs与RT p66亚基结合能力无较大改变,推论RT聚合酶活性变化较小；③确定的分离株中RNase H存在突变,该突变可能造成RNase H活性改变,即有活性升高的可能。本研究采用分子克隆技术将相应突变位点引入野生型HIV-1 RT表达质粒(p6HRT-Pr)中,构建上述6个突变HIV-1毒株的逆转录酶表达质粒：RT5326、RT5329、RT5512、RT5331、RT6316和RT6853(注：下标为病例号)。然后,应用PDMI和p6HRT-Pr双质粒表达体系将野生和6个突变毒株逆转录酶原核表达,并应用镍离子亲和层析法分离纯化,再用荧光测定法和酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)分别测定RTwt和6个突变逆转录酶的RNase H活性和RDDP活性。结果显示其中5个突变逆转录酶RNase H活性下降或无明显变化,只有RT5329 (RTN460D/T468S/K530R/A554T/V5591) RNase H活性升高约20%,RDDP活性降低约6%,初步确定将从5329病例分离得到的突变HIV-1毒株用于后续研究。然后本论文合成了5329突变毒株RNase H基因,再通过酶切连接将其替换入HIV-1野生重组病毒基因HIV-1 (pNL4-3),获得HIV-15329突变质粒。然后采用改良磷酸钙转染法构建野生型和5329突变毒株模式病毒,以VSVG/HIV-15329为实验组,以VSVG/HIV-1wt为对照组,比较AZT、3TC和EFV以及联合用药对野生和突变重组病毒的药效学,评价在细胞水平逆转录酶RNase H活性升高对现有逆转录酶抑制剂及其联合用药的药效学影响。结果显示,AZT、3TC (NRTIs)和EFV、NVP、ETR (NNRTIs)单个药物抑制HIV-1wt和HIV-15329复制的半数抑制浓度无明显差异；AZT/3TC/EFV联合使用抑制HIV-1wt和HIV-15329复制,药物间均表现为强协同作用,CI值均小于1分别为0.57和0.61,即AZT/3TC/EFV联合用药抗HIV-1wt体外药效学略优于抗HIV-15329体外药效学。综合分析,RNase H活性升高20%对聚合酶抑制剂单个药物和联合用药药效无明显促进或拮抗作用,我们需要进一步研究升高RNase H活性对HIV-1逆转录过程的影响,同时尝试不同方法大幅度提高RNase H活性(100%)深入研究高RNaseH活性对聚合酶抑制剂药效学及逆转录过程的影响。该研究对理解RNase H在HIV逆转录过程中的作用机制和耐药HIV的药物研发有一定参考价值。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.91

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本文编号：1315702