钩虫病患者血清对美洲钩虫抗原反应性分析及美洲钩虫成虫cDNA文库的构建

发布时间：2017-12-30 01:12

本文关键词：钩虫病患者血清对美洲钩虫抗原反应性分析及美洲钩虫成虫cDNA文库的构建　出处：《中国疾病预防控制中心》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：钩虫病仍在我国广大农村流行,严重危害人民健康,是重要的公共卫生问题。有效的诊断方法对于此病的防治非常关键,粪检法仍是目前最普遍应用的诊断方法。随着防治工作的深入,人群感染率和感染度降低,此方法已不能满足防治工作需要,迫切需要快速简便的免疫学检测方法应用于现场大规模筛查或诊断,而诊断抗原是建立有效免疫学检测方法的基础。本研究以美洲钩虫成虫为材料,对其应用不同方法进行处理,得到四种可溶性粗抗原(分别记为A、B、C和D抗原),应用ELISA法对其检测效能进行评价,并选取检测效能较高的抗原应用于钩虫病人血清抗体反应性分析,以确定钩虫病人血清中优势抗体(亚)类,从而为建立敏感特异检测钩虫病的免疫检测方法提供依据；另外,本研究通过Gateway技术构建钩虫cDNA入门文库和表达文库,将应用确诊的钩虫病人混合血清对cDNA表达文库进行筛选,并对筛选到的基因进行序列分析和编码蛋白分析；诱导表达重组蛋白,应用ELISA方法对重组蛋白的诊断价值进行评价。分别以制备的A、B、C、D四种美洲钩虫成虫可溶性粗抗原作为包被抗原,以酶标记抗人IgG作为二抗,以ELISA法检测钩虫病患者血清、健康入和其它寄生虫病患者血清,其检测的敏感性分别为87.75%、86.73%、87.75%和93.87%；特异性分别为76.12%、74.63%、73.13%和80.60%；诊断效能分别为83.03%、81.82%、81.82%和88.48%。表明D抗原具有很好的免疫检测效能。选取诊断效能较高的D抗原作为包被抗原,分别以酶标记抗人IgM、IgD、IgE、IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4和IgG作为二抗,以ELISA法检测钩虫病患者血清,其检测的敏感性依次为41.84%、2.04%、1.02%、19.39%、25.51%、17.35%、88.78%和92.93%；检测健康人和其它寄生虫病患者血清的特异性依次为77.61%、97.01%、92.54%、95.52%、92.53%、92.53%、92.53%和79.10%；诊断效能依次为56.36%、40.61%、38.18%、50.30%、52.73%、47.88%、90.30%和87.88%。表明IgG4和IgG是钩虫病血清中优势抗体(亚)类。本研究使用美洲钩虫成虫为材料构建了美洲钩虫cDNA入门文库,其平均滴度为3.0×1O5cfu/ml,库总容量为3.0×105cfu；基于构建的入门文库构建了美洲钩虫成cDNA表达文库,其平均滴度为1.9×104cfu/ml,总容量为1.9×104cfu,平均插入片段大小为1010kb,重组率为85%。应用确诊的钩虫病人混合血清筛选cDNA文库,筛选出2个强阳性克隆,经测序和序列分析,S1插入片段长度为1042bp,编码的蛋白与已报道的美洲钩虫β一微管蛋白高度同源(99%)；S2插入片段长度为937bp,编码的蛋白与已报道的美洲钩虫一未知蛋白高度同源。对S1和S2编码蛋白的二级结构进行分析预测,表明两者均具有很好的抗原性。然后对S1和S2编码基因进行了诱导表达和纯化,对纯化蛋白应用ELISA法评价了它们的诊断效能,结果显示S1和S2重组蛋白检测的敏感性分别为88.42%和91.58%；特异性分别为77.27%和95.45%,二者检测的诊断效能分别为83.85%和93.17%。这些结果表明,本项研究已成功构建了美洲钩虫成虫cDNA表达库,为筛选诊断靶分子提供了基础；筛选出的S2重组蛋白显示了很好的诊断潜能,经过进一步研究有望开发出检测钩虫病的试剂盒。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R532.12

【参考文献】