肠内营养对艾滋病患者肠屏障功能的影响及机制研究

发布时间：2018-01-24 23:30

本文关键词： 艾滋病肠屏障实时荧光定量PCR 酶联免疫吸附实验细胞因子艾滋病肠道屏障功能肠内营养实时荧光定量PCR 酶联免疫吸附实验　出处：《昆明医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分：艾滋病患者肠道屏障功能的变化和机制研究目的研究艾滋病患者肠道机械屏障、生物屏障及免疫屏障功能的变化,探讨艾滋病对肠道屏障的影响,并初步揭示其相关机制。方法应用培养法进行大肠杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌及乳酸杆菌的测定,并提取待测粪便标本细菌DNA,应用实时荧光定量PCR技术,研究艾滋病患者肠道生物屏障功能的变化：根据细菌的cfiA基因序列设计脆弱类杆菌的特异性引物,16S rRNA基因序列设计双歧杆菌属引物,rrnA-16S基因序列设计梭菌属的特异性引物,cfxA基因序列设计类杆菌属的特异性引物,gyrB基因序列设计坏死梭杆菌的特异性引物,ddl基因序列设计粪肠球菌及屎肠球菌的特异性引物；swp84基因序列设计艰难梭菌的特异性引物,mob基因序列设计单形类杆菌的特异性引物,16S rRNA基因序列设计多形类杆菌、梭杆菌属的特异性引物；rpoB基因序列设计卵形类杆菌、吉氏类杆菌、普通类杆菌的特异性引物,BoNT基因序列设计肉毒梭菌的特异性引物,16S rRNA基因序列设计乳酸杆菌属、大肠杆菌,收集艾滋病患者粪便标本50份和健康人粪便标本50份,测定不同细菌的数量,分析两组人群肠道微生态的差异。应用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附(ELISA)实验,研究艾滋病患者肠道机械屏障功能的变化：收集艾滋病患者血液标本50份和健康人血液标本50份,提取血浆,测定二胺氧化酶(DAO)、血浆D-乳酸(D-LA)、血浆脂多糖/内毒素(LPS)、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)、抗内毒素核心抗体(EndoCab)及可溶性CD14(sCD14)的指标变化,分析AIDS患者肠道机械屏障功能的变化情况。应用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附(ELISA)实验,研究艾滋病患者肠道免疫屏障功能的变化：收集艾滋病患者血液标本50份和健康人血液标本50份,提取血浆,测定分泌型免疫球蛋白A (sIgA),白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor, TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、细胞凋亡膜表面分子(FAS)及细胞凋亡膜表面分子配体(FASL)的指标变化,应用流式细胞仪检测患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞的变化,分析AIDS患者肠道免疫屏障功能的变化情况；测定肱三头肌皮褶厚度,上臂周径,淋巴细胞总数,体重指数,血清前白蛋白,血清白蛋白,血红蛋白,分析AIDS患者营养状况。结果正常对照组与艾滋病患者组粪便中细菌数量培养法分别为大肠杆菌(5.35±0.52 vs 6.51±0.62)、双歧杆菌属(8.63±0.71 vs 4.48±0.27)、粪肠球菌(5.72±0.38 vs 6.52±0.61)及乳酸杆菌属(7.38±0.44 vs 3.54±0.36)。实时荧光定量PCR法分别为乳酸杆菌属(7.35±0.46 vs 5.12±0.48)和双歧杆菌属(9.14±0.72 vs5.74±0.58)数量较正常组明显减少(P0.05)。粪肠球菌(5.85±0.55 vs 7.08±0.72),大肠杆菌(5.77±0.43 vs 7.58±0.78),屎肠球菌(5.24±0.54 vs 7.38±0.76),梭杆菌属(7.95±0.83 vs 8.79±0.64),类杆菌属(7.67±0.85 vs 8.66±0.58),梭菌属(4.55±0.38 vs 6.13±0.24),类杆菌属中吉氏类杆菌为(4.22±1.21 vs 5.54±1.46)、脆弱类杆菌为(3.25±0.48 vs 4.06±0.58)、普通类杆菌为(2.93±0.30 vs 4.49±1.22),单形类杆菌为(5.58±0.85 vs 6.72±0.83)、卵形类杆菌为(5.76±1.02 vs 7.07±1.65)、多形类杆菌为(5.02±0.51 vs 6.42±1.34)、梭菌属中的肉毒梭菌为(2.78±1.14 vs5.38±0.45)；艰难梭菌为(1.65±0.26 vs 3.45±0.47),梭杆菌属中的坏死梭杆菌为(2.32±0.26 vs 6.34±0.62),艾滋病组数量较正常组明显增多(P0.05)。正常对照组与艾滋病患者组血浆二胺氧化酶(DAO)为(0.97±0.18 u/ml vs 1.43 ±0.28 u/ml)、血浆D-乳酸(D-LA)为(25.92±3.25umol／L vs 38.92±5.89 umol/L)、血浆脂多糖/内毒素(LPS)为(32.82±5.28 ng/ml vs 66.68±7.85 ng/ml)、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)为(99.12±10.56 Pg/ml vs 156.22±18.78 Pg/ml)、血浆可溶性CD14(sCD14)为：(0.43±0.03 ug/mL vs 0.74±0.22 ug/mL)、血浆抗内毒素核心抗体(EndoCAb)为(20.36±0.88 MMU/L vs 24.33±2.34 MMU/L)艾滋病组较正常组明显增多(P0.05),差异有统计学意义。血浆分泌型IgA(sIgA)为：(62.4±14.21pg/mL vs 27.56±1.43 pg/mL)、白细胞介素-12(IL-12)为：(2.74±0.35pg/mL vs 0.72±0.32 pg/mL)、白细胞介素-17(IL-17)为：(20.28 ±4.83pg/mL vs 5.75±0.97pg/mL)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)为：(11.4± 4.12pg/mL vs 6.61±1.32 pg/mL)、白细胞介素-1β(IL-1β)为：(23.2±3.21pg/mL; 7.03±0.60pg/mL)及白细胞介素-6(IL-6)为：(10.86±4.15ng/L vs 1.13± 0.47ng/L),CD4+为：(40.75±4.73 vs 30.52±4.52).CD8+为：(23.72±3.72 vs 14.75 ±1.58)、CD4+/CD8+T细胞为：(1.86±0.83 vs 1.26±0.23),肱三头肌皮褶厚度(TSF)为：(11.28±1.82mm vs 7.08±0.17mm),上臂周径(AC)为：(24.82± 3.28cm vs 20.75±2.78cm),淋巴细胞总数(TLC)为：(1.79±0.54 vs 0.78±0.12),体重指数(BMI)为：(22.8±0.58 vs 17.12±0.23),血清前白蛋白(PALB)为：(180.5±20.5 vs 110.5±13.2),血清白蛋白(ALB)为：(38.5±3.85 vs 27.25±2.87),血红蛋白(Hb)为：(123.35±13.83 vs 98.28±10.12),艾滋病组较正常组明显减少(P0.05),白细胞介素-10(IL-10)为：(37.6±10.5ug/L vs 79.5±13.2 ug/L)、细胞凋亡膜表面分子(FAS)为：(0.33±0.12 pg/mL vs 1.21±0.13 pg/mL)及细胞凋亡膜表面分子配体(FASL)为：(42.21±5.14 Pg/mL vs 82.49±6.72 pg/mL)艾滋病组较正常组明显升高,差异有统计学意义。结论艾滋病患者肠道微生态发生了明显变化,提示艾滋病患者的肠道菌群失调,细菌和内毒素移位；艾滋病患者肠机械和免疫屏障功能明显受损,营养状况和免疫水平明显降低。第二部分：肠内营养对艾滋病患者肠道屏障功能的影响及机制研究目的研究艾滋病患者服用肠内营养前和服用4周后肠道生物屏障、机械屏障及免疫屏障功能的变化,探讨对艾滋病患者肠道屏障的影响,为进一步研究其发生机制及临床治疗艾滋病提供新的理论依据及实践意义。方法将艾滋病患者(n=50)给予普通肠内营养治疗。于4周后采集患者粪便标本,提取细菌DNA,应用实时荧光定量PCR反应测定细菌的数量；收集患者血液标本,提取血浆,应用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附(ELISA)实验,测定二胺氧化酶(DAO)、血浆D-乳酸(D-LA)、血浆脂多糖/内毒素(LPS)、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)、抗内毒素核心抗体(EndoCab)及可溶性CD14(sCD14)的指标变化,分析AIDS患者肠道机械屏障功能的变化情况。应用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附(ELISA)实验,测定测定分泌型免疫球蛋白A (sIgA),白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor, TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、细胞凋亡膜表面分子(FAS)及细胞凋亡膜表面分子配体(FASL)的指标变化,分析AIDS患者肠道免疫屏障功能的变化情况。应用流式细胞仪检测患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞的变化,分析肠内营养后AIDS患者肠道免疫屏障功能的变化情况；测定肱三头肌皮褶厚度,上臂周径,淋巴细胞总数,体重指数,血清前白蛋白,血清白蛋白,血红蛋白,分析肠内营养后AIDS患者营养状况的改善情况。结果艾滋病患者服用肠内营养4周前后比较,粪便中细菌数量培养法分别为乳酸杆菌属(3.54±0.36；6.76±1.26),双歧杆菌属(4.48±0.27 vs 7.15±0.72)数量较服用前明显增加(P0.05)。大肠杆菌(6.51±0.62 vs 5.23±0.55),粪肠球菌(6.52±0.61 vs 4.82±0.42)。实时荧光定量PCR法分别为乳酸杆菌属(5.12±0.48vs 7.86±1.13),双歧杆菌属(5.74±0.58 vs 8.25±1.27)数量较服用前明显增加(P0.05)。大肠杆菌(7.58±0.78vs6.21±1.07),粪肠球菌(7.08±0.72vs4.78±0.82),屎肠球菌(7.38±0.76 vs 6.13±0.87),梭杆菌属(8.79±0.64 vs 7.62±0.54),类杆菌属(8.66±0.58 vs 7.55±0.44),梭菌属(6.13±0.24 vs 4.32±0.38),类杆菌属中吉氏类杆菌为(5.54±1.46 vs 4.33±1.22)、脆弱类杆菌为(4.06±0.58vs3.14±0.42)、普通类杆菌为(4.49±1.22 vs 3.21±0.46)、单形类杆菌为(6.72±0.83 vs 5.67±0.62)、卵形类杆菌为(7.07±1.65 vs 5.85±1.21)、多形类杆菌为(6.42±1.34 vs5.12±0.63)、梭菌属中的肉毒梭菌为(5.38±0.45vs2.47±0.34)；艰难梭菌为(3.45±0.47 vs 1.43±0.24),梭杆菌属中的坏死梭杆菌为(6.34±0.62 vs 3.57±0.46),服用肠内营养后数量明显降低(P0.05)。血浆二胺氧化酶(DAO)为(1.43±0.28u/ml .vs 1.23±0.13 u/ml)、血浆D-乳酸(D-LA)为(38.92±5.89umol/L vs 30.44 ±4.81 umol/L)、血浆脂多糖/内毒素(LPS)为(66.68±7.85ng/ml vs 51.03± 5.26 ng/ml)、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)为(156.22±18.78pg/ml vs 120.75± 15.55Pg/ml)、血浆可溶性CD14(sCD14)为：(0.74±0.22ug/mL vs 0.58± 0.24ug/mL)、血浆抗内毒素核心抗体(EndoCAb)为(24.33±2.34MMU/L vs 22.18 ±2.15MMU/L)服用肠内营养后数量明显降低(P0.05),差异有统计学意义。血浆分泌型IgA(sIgA)为：(27.56±1.43 pg/mL；43.30±3.16 pg/mL)、白细胞介素-6(IL-6)为：(1.13±0.47ng/L vs 2.72±0.52ng/L)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为：(6.61±1.32 pg/mL vs 8.77±1.22 pg/mL)、白细胞介素-1β(IL-1β)为：(7.03 ±0.60pg/mL vs 9.36±1.48pg/mL)、白细胞介素-12(IL-12)为：(0.72±0.32 pg/mL vs 1.53±0.27pg/mL)及白细胞介素-17(IL-17)为：(5.75±0.97pg/mL vs 8.79 ±0.36pg/mL),服用肠内营养后数量明显升高(P0.05),白细胞介素-10(IL-10)为：(79.5±13.2 ug/L vs 48.3±11.2 ug/L)、细胞凋亡膜表面分子(FAS)为：(1.21±0.13pg/mL vs 0.52±0.12pg/mL)及细胞凋亡膜表面分子配体(FASL)为：(82.49±6.72pg/mL vs 49.61±4.76pg/mL)服用肠内营养后数量明显降低(P0.05),差异有统计学意义；CD4+为：(30.52±4.52 vs 38.25±3.82)、CD8+为：(14.75±1.58 vs 21.57±3.14).CD4+/CD8+T细胞为：(1.26±0.23 vs 1.78±0.42),肱三头肌皮褶厚度(TSF)为：(7.08±0.17mm vs 10.06±1.28mm),上臂周径(AC)为:(20.75±2.78cm vs 23.28±2.35cm),淋巴细胞总数(TLC)为:(0.78±0.12vs 1.62±0.25),体重指数(BMI)为：(17.12±0.23 vs 21.62±2.26),血清前白蛋白(PALB)为：(110.5±13.2 vs 165.32±17.25),血清白蛋白(ALB)为：(27.25±2.87 vs 32.24±3.32),血红蛋白(Hb)为：(98.28±10.12 vs 110.21±11.15),艾滋病患者服用肠内营养后明显升高,差异有统计学意义。结论肠内营养对艾滋病患者肠道益生菌有升高作用,抑制肠道条件致病菌,能改善艾滋病患者肠道微生态。肠内营养对AIDS患者的肠道机械和免疫屏障功能具有修复作用,能改善其营养状态和免疫功能,为进一步研究其发生机制及临床治疗提供新的理论依据及实践意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.91

【参考文献】