CSP下调自噬相关蛋白在其抑制IFN-γ杀伤EEF中的作用和机制研究
本文关键词： 疟疾 肝细胞 自噬 IFN-γ 出处：《第三军医大学》2016年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：当前疟疾依然是世界上危害最为严重的三大传染病之一,疟疾的病原体是疟原虫,其生活史主要包括肝期、红内期和蚊期。肝期是疟原虫感染宿主的始动时期,若能阻断肝期感染则能从源头上控制疟疾。揭示肝期疟原虫与宿主细胞相互作用及其逃避或抑制宿主免疫系统的机制将为研究新的肝期疟原虫阻断策略提供新的靶点及理论依据。而由于按蚊饲养及感染平台的限制,目前对于肝期疟原虫与宿主细胞相互作用机制仍然知之甚少。现有的研究认为肝期疟原虫入侵宿主肝细胞后,子孢子表面环子孢子蛋白CSP(circumsporozoite protein)能够脱落并被水解成为ΔCSP,ΔCSP溢出纳虫空泡进入肝细胞胞浆则促进疟原虫在肝细胞内的发育。但其具体机制并不清楚。而本研究发现转染重组CSP或ΔCSP质粒并不能够直接显著地促进肝细胞内疟原虫EEF(Exo-erythrocytic Forms)的发育,却能够显著地抑制IFN-γ对胞内EEF的杀伤作用。进一步研究发现,转染重组ΔCSP质粒能够抑制肝细胞自身自噬相关蛋白的表达水平。而目前尚不清楚宿主肝细胞自身自噬是否参与调节肝期疟原虫EEF的生长发育以及IFN-γ对肝细胞内EEF的杀伤作用。因此,为了解释这一现象,本研究在该研究基础之上从体内体外进一步证实了ΔCSP对肝期疟原虫EEF的生长发育、IFN-γ杀伤EEF作用及宿主肝细胞自身自噬水平的影响;探讨了宿主肝细胞自身自噬水平对肝期疟原虫EEF的生长发育、IFN-γ杀伤EEF作用的影响;随后借助CSP pexel功能域突变子孢子以及肝细胞ATG5条件敲除小鼠来验证体外实验结果;最后通过eXact-His双标签纯化系统及蛋白质谱技术,初步探讨了ΔCSP下调肝细胞内自噬相关蛋白的具体分子机制。可为设计新的疟疾肝期阻断策略提供新的靶点及立论依据。一、ΔCSP对肝期疟原虫发育、IFN-γ杀伤EEF及肝细胞自噬的影响:1、转染重组CSP或ΔCSP并不能显著促进肝期EEF的生长发育:通过构建并转染重组CSP及ΔCSP质粒至HepG2-CD81细胞,随后感染P.yoelii 265BY子孢子,感染42h后采用探针定量q-PCR实验对肝细胞内疟原虫虫荷进行分析。结果显示:转染重组CSP或ΔCSP质粒并不能显著促进肝期EEF的生长发育。2、转染重组csp或Δcsp能够显著抑制ifn-γ对肝期eef的杀伤作用:在转染重组csp及Δcsp质粒至hepg2-cd81细胞之后,加入1u/mlifn-γ进行处理,感染24h后分别采用间接免疫荧光实验对肝细胞内eef直径、大小、lc3共聚率和lamp-1共聚率进行统计分析,以及42h后采用探针定量q-pcr实验对肝细胞内疟原虫虫荷进行分析。结果显示:转染重组csp或Δcsp质粒组eef的直径、大小并不受ifn-γ影响,说明Δcsp能够抑制ifn-γ对eef的杀伤作用。3、转染重组csp或Δcsp能够显著抑下调肝细胞自噬相关蛋白表达水平:为了探讨Δcsp抑制ifn-γ杀伤eef作用的机制,本研究通过转染重组csp及Δcsp质粒至hepg2-cd81细胞之后,分时间点0h,6h,12h和24h裂解细胞,通过westernblot实验对自噬相关蛋白lc3、atg7、beclin-1及p62(sqstm1)的表达水平进行检测,结果显示:随着时间推移,转染Δcsp重组质粒后lc3及atg7蛋白水平显著降低,p62则出现一定积累,说明转染Δcsp重组质粒可以明显抑制hepg2-cd81细胞自噬相关蛋白的表达。二、自噬对肝期疟原虫发育及ifn-γ杀伤作用的影响:1、肝细胞条件敲除atg5限制肝细胞内eef生长发育:为了探讨肝细胞自噬对eef生长发育的影响,本研究通过过杂交构建了肝细胞atg5条件敲除小鼠,随后采用尾静脉注射感染p.yoelii265by子孢子。42h后,取小鼠肝脏病对其虫荷进行探针定量q-pcr检测,结果显示当肝细胞atg5条件性缺失的时候,肝细胞内eef生长发育受到限制,提示肝期疟原虫的发育需要肝细胞自噬参与,但其分子机制并不清楚。2、促进或抑制肝细胞自身自噬水平却不能显著影响肝期eef发育:为了探讨自噬参与调节肝期疟原虫发育的机制,本研究采用了自噬促进剂rapamycin和自噬抑制剂ly294002处理分别调节hepg2-cd81细胞自噬水平,随后加入p.yoelii265by子孢子感染,感染24h后分别采用间接免疫荧光实验对肝细胞内eef直径、大小、lc3共聚率和lamp-1共聚率进行统计分析,以及42h后采用探针定量q-pcr实验对肝细胞内疟原虫虫荷进行分析。结果显示:无论rapamycin或者ly294002调解肝细胞自噬后都无法对eef的直径、大小产生影响,探针定量q-pcr实验结果也获得了同样的结果。3、促进或抑制肝细胞自身自噬水平却能显著影响ifn-γ对eef的杀伤作用:以上体内体外的实验得到了不同的结果,而其不同点在于体内有ifn-γ存在,而体外并没有。为了探讨肝细胞自噬水平对ifn-γ杀伤eef能力的影响,本研究在使用自噬促进剂rapamycin和自噬抑制剂ly294002处理分别调节hepg2-cd81细胞自噬水平的同时,加入了ifn-γ对eef进行杀伤,同样在感染24h后分别采用间接免疫荧光实验对肝细胞内eef直径、大小、lc3共聚率和lamp-1共聚率进行统计分析,以及42h后采用探针定量q-pcr实验对肝细胞内疟原虫虫荷进行分析。结果显示:rapamycin促进肝细胞自噬水平后能够显著促进0.2u/mlifn-γ的杀伤作用,ly294002抑制肝细胞自噬水平后却能够显著抑制0.5u/ml和1u/ml对eef的杀伤作用。结果说明调节肝细胞自噬水平能够显著影响ifn-γ对eef的杀伤。4、肝细胞条件敲除atg5使ifn-γ失去杀伤eef的能力随后对该现象进行了体内验证,对肝细胞条件敲除小鼠atg5腹腔注射拮抗抗体中和体内ifn-γ作用,随后尾静脉注射感染p.yoelii265by子孢子,感染42h后,采用探针定量q-pcr对小鼠肝脏内虫荷进行检测。结果显示:使用拮抗抗体中和ifn-γ后的小鼠肝脏虫荷与未拮抗组并无显著性统计学差异,说明肝细胞完全缺失自噬情况下,ifn-γ也无法发挥杀伤eef的功能。三、Δcsp下调自噬相关蛋白抑制ifn-γ对eef的杀伤作用:1、共转染atg3/5/7能够恢复被Δcsp抑制的ifn-γ的杀伤作用:前期的研究结果显示抑制肝细胞自噬水平能够抑制ifn-γ对eef的杀伤作用。为了探讨Δcsp抑制肝细胞自噬相关蛋白表达水平与其抑制ifn-γ杀手作用的关系,本研究构建了重组atg3/5/7质粒,并与Δcsp共转染至hepg2-cd81细胞,随后加入p.yoelii265by子孢子感染,42h后采用探针定量q-pcr对细胞内的虫荷进行检测。结果显示:共转染atg3/5/7能不同程度的恢复被Δcsp抑制的ifn-γ杀伤作用。2、构建csppexel功能域突变子孢子:体外的研究结果显示:csp可能通过下调自噬相关蛋白从而抑制ifn-γ对eef的杀伤作用。由于csp蛋白对子孢子的发育成熟非常关键,缺失csp的子孢子将无法存活。为了从生理状态下验证这一结果,本研究通过crispr-cas9技术构建了csp无法溢出纳虫空泡的csppexel功能域突变的p.yoelii265by子孢子。下一步将在拮抗或不拮抗ifn-γ情况下进行体内实验,探讨生理状态确实csp进入胞浆对ifn-γ杀伤作用的影响。四、Δcsp下调自噬相关蛋白的机制初探:1、构建稳定表达exact-his双标签Δcsp的hepg2-cd81细胞系:为了深入探讨Δcsp下调hepg2-cd81细胞的具体分子机制。本研究利用慢病毒感染的方式构建了稳定表达exact-his双标签Δcsp的hepg2-cd81细胞系。2、串联质谱分析HepG2-CD81细胞中可能与ΔCSP直接相互作用的蛋白:将1×10~7稳定表达eXact-His双标签ΔCSP的HepG2-CD81细胞与对照空质粒病毒感染的细胞分别裂解,并通过Profinity eXact Purification Resin(Bio-rad)和Ni-NTA Agarose(Qiagen)的两次纯化后,对洗脱液进行串联质谱实验。结果显示:ΔCSP可能通过与HSPA8作用下调细胞中自噬相关蛋白的表达水平。本研究首次发现转染重组子孢子ΔCSP质粒可以抑制IFN-γ杀伤EEF,并可以抑制肝细胞自噬蛋白的表达水平。而ΔCSP可能通过HSPA8下调自噬相关蛋白ATG的表达水平从而抑制了IFN-γ的杀伤作用。肝期是疟疾感染的始动时期,并无临床症状,若能将疟原虫感染阻断在肝期则能从源头上控制住疟疾的感染。因此深入揭示肝期疟原虫与宿主细胞相互作用及其逃避或抑制宿主免疫系统的机制将为研究新的肝期疟原虫阻断策略提供新的靶点及理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R531.3
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，本文编号：1482270
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