汉滩病毒感染引起血管内皮细胞炎症因子的产生及诱发炎症反应的机制

发布时间：2018-02-21 19:33

  本文关键词： CXCL10 IL-33 肾综合征出血热 汉滩病毒 内皮细胞 细胞因子风暴　出处：《第四军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染在人类可引起的严重的死亡率高达2%-10%的肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS),全球每年约有100,000病例,其中90%以上发生在我国,陕西省为HFRS的高发区。HFRS患者的主要临床表现为发热、出血、血小板数量下降和急性肾功能不全。由于HTNV感染在宿主啮齿类动物上无疾病表现,因缺乏合适的动物模型,目前对于HTNV感染导致HFRS的致病机制尚不清楚。血小板功能障碍和毛细血管内皮细胞损伤为HFRS患者的主要病理表现,有研究表明,过度活化的免疫应答和炎症反应引起的“细胞因子风暴”可能是导致HFRS致病的机理之一。但目前对于HTNV感染通过怎样的机制引起细胞因子产生以及如何诱发“细胞因子风暴”尚不清楚。在我们前期工作中,用Luminex技术检测了HFRS患者血清中多种细胞因子的表达,其中CXCL10是表达最高的一种细胞因子。CXCL10又称为IFN-γ诱导蛋白10,是CXC趋化因子家族的成员,主要由内皮细胞,上皮细胞和角质形成细胞分泌产生。CXCL10与受体CXCR3结合后,可趋化淋巴细胞至感染发生部位,还可介导凋亡,细胞生长以及血管生成。在其他病毒感染性疾病,如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、呼吸道轮状病毒、鼻病毒、登革病毒等感染性疾病中,CXCL10均急剧升高,并与疾病的进展及严重程度相关。CXCL10可趋化淋巴细胞至感染发生部位,发挥抗感染的功能;也可作为“细胞因子风暴”中的一员加重机体炎症反应,趋化淋巴细胞至病毒感染的靶细胞,引起靶细胞发生免疫病理损伤。所以,cxcl10究竟是起保护宿主的作用还是起损伤宿主的作用取决于宿主的免疫状态及其基因背景。在htnv感染模型中,尚不清楚cxcl10可能发挥的作用。有研究发现很多信号通路如jak-stat途径、pi3k/akt途径以及traf2/tak1途径可调控cxcl10的表达,nf-κb、irf1和irf3等转录因子也被报道可结合于cxcl10的启动子区。尽管geimonen等报道htnv感染内皮细胞可引起cxcl10的表达升高,但是对于htnv通过怎样的途径调控cxcl10产生仍不清楚。在本课题第一部分中,我们将解决两个以下两个问题:(1)研究cxcl10在hfrs疾病中可能发挥的作用;(2)htnv通过怎样的信号转到途径诱导cxcl10的产生。首先,我们收集了hfrs患者的血清,检测hfrs患者血清中cxcl10的含量,并分析cxcl10的含量与病情之间的关系。随后建立体外htnv感染原代内皮细胞模型,探索cxcl的产生来源,并研究在内皮细胞中,htnv调控cxcl10产生的可能的分子机制。在本研究中,我们发现,hfrs患者血清中cxcl10表达急剧升高,在hfrs发病急性期尤为显著。通过相关性分析我们发现cxcl10与hfrs患者的白细胞计数、尿素氮和血清肌酐呈正相关,与血小板计数呈负相关,且血浆病毒载量高的患者其cxcl10的水平也高。随后通过检测hfrs外周血淋巴细胞各亚群表面cxcl10受体cxcr3的表达水平,发现在hfrs发病急性期,单核细胞表面cxcr3急剧升高,提示在发病急性期,高水平的cxcl10可能可诱导单核细胞至内皮细胞。在体外实验中我们发现,htnv感染后的原代内皮细胞可表达大量的cxcl10。而且,htnv并非通过其病毒蛋白调控cxcl10的表达,而是通过其病毒rna中的dsrna结构,激活tlr3、rig-i和mda-5途径,引起转录因子nf-κb和irf7发生磷酸化和核转位,随后nf-κb的亚基p50和p65以及irf7结合于cxcl10的启动子区,调控cxcl10的转录过程。这些研究有助于我们理解cxcl10及其参与其中的“细胞因子风暴”在病毒感染性疾病中的作用,可更好的为hfrs的治疗提供理论依据。il-33是il-1细胞因子家族的新成员,以往研究发现il-33是“孤受体”st2的配体。在细胞处于静止或凋亡状态下,il-33可作为转录因子存在与细胞核内,当细胞发生坏死,il-33则可从胞内释放。因此,il-33被认为是“警报素”,作为危险相关模式分子(danger-associatedmolecularpattern,damp)家族的成员,il-33的释放可警示免疫系统机体受到感染或损伤。研究发现,il-33可激活th2介导的免疫反应,促进th2相关的细胞因子,如il-4、il-5和il-13的产生。在以th2免疫应答介导的疾病中,il-33可引起内皮细胞和上皮细胞发生炎症反应。il-33的受体st2由于编码后对蛋白的剪切不同,可形成三种不同的蛋白剪切体,分别为膜表面st2l、膜表面变体型st2v和分泌至胞外的可溶型sst2。可溶型sst2可作为il-33的诱饵受体,竞争il-33与st2l的结合,中和il-33/st2l途径激活后可产生的生理或病理效果。st2l与il-33结合后,st2l与il-1受体辅助蛋白(il-1raccessoryprotein,il-1racp)形成复合体,募集myd88,激活mapk和nf-κb途径,促进促炎因子的释放。很多研究报道了il-33/st2途径在不同疾病中的表达及作用。在呼吸道炎症疾病、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病中,il-33/st2途径参与炎症病理损伤的发生过程。然而在hfrs中,il-33/st2如何调控免疫反应仍不清楚。在本课题的第二部分中,我们将解决以下两个问题:(1)研究il-33/st2途径在hfrs中如何发挥免疫调节的作用;(2)研究il-33/st2与htnv感染协同作用诱导内皮细胞炎症反应的分子机制。首先,我们收集hfrs患者血浆,检测其血浆中il-33及sst2的含量,并分析二者与hfrs患者病情的相关性。随后,在体外htnv感染内皮细胞模型中,检测il-33/st2对内皮细胞发生炎症反应的调控。最后,应用体外htnv感染内皮细胞模型探索il-33/st2与htnv感染协同调控内皮细胞炎症反应的分子机制。在本研究中,我们发现il-33及其诱饵受体sst2在hfrs血浆中均高表达。通过相关性分析发现,il-33与sst2与患者病情严重程度均呈正相关,且二者含量之间也呈正相关。随后,我们在体外htnv感染内皮细胞模型中发现,il-33可通过st2介导的途径促进htnv感染的内皮细胞产生大量的促炎细胞因子,引起“细胞因子风暴”,促进内皮细胞发生炎症反应。而sst2则可抑制内皮细胞炎症反应的发生。而且,il-33和htnv可通过共同活化nf-κb途径达到协同促进炎症反应的作用。该研究提示IL-33可能是HTNV感染导致“细胞因子风暴”的诱发因子,而该炎症反应的过程可被sST2抑制。IL-33/ST2共同调控HTNV感染后的免疫应答,为治疗HFRS提供了新的思路。
[Abstract]:Hantaan virus (Hantaan, virus, HTNV) infection in humans caused by severe 2%-10% of mortality rate of hemorrhagic fever with renal syndrome (hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS), there are approximately 100000 cases worldwide each year, more than 90% of which occurred in our country, Shaanxi Province as the main clinical manifestations of HFRS in patients with.HFRS fever, bleeding, platelet count decreased and acute renal insufficiency. Because the host rodent animal no disease manifestations of HTNV infection, due to the lack of a suitable animal model for HTNV infection, the pathogenic mechanism of HFRS is unclear. Dysfunction of platelet and endothelial cell injury is the main pathological manifestations of patients with HFRS. Research shows that excessive activation of the immune response and inflammation caused by "cytokine storm" may lead to the pathogenesis of HFRS. But the mechanism of HTNV infection by how The mechanisms leading to cytokine production and how to induce "cytokine storm" is not clear. In our previous work, the expression of a variety of cytokines in the serum of patients with HFRS were detected by using Luminex CXCL10 technology, which is an expression of cytokines with the highest.CXCL10 also known as IFN- gamma inducible protein 10, CXC is more members factor family, is mainly composed of endothelial cells, epithelial cells and keratinocytes secrete.CXCL10 and CXCR3 receptor binding, chemotaxis to lymphocyte infection, can mediate apoptosis, cell growth and angiogenesis. In other viral infections, such as hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency respiratory virus, influenza virus, rotavirus, rhinovirus, dengue virus infection in CXCL10 were increased dramatically, and more with the progression of the disease and the severity of.CXCL10 Lymphocyte to infection, play anti infection function; also can be used as a member of "aggravated inflammation cytokine storm in the trend of lymphocyte to target cell virus infection, cause immune pathological injury occurred in target cells. Therefore, whether CXCL10 protects the host's role or function depends on the damage of the host the immune status of host and its genetic background. In the model of HTNV infection is not clear, CXCL10 may play a role. Some studies found that many signaling pathways such as JAK-STAT pathway, pi3k/akt pathway and traf2/tak1 pathway can regulate the expression of CXCL10, IRF1 and nf- kappa B, IRF3 transcription factors have been reported to be the promoter region binding to CXCL10. Although geimonen reported HTNV infection of endothelial cells can increase the expression of CXCL10, but for HTNV produced by the CXCL10 control approach is still not clear how. The first part of this paper, we will address the following two questions: two (1) of CXCL10 in HFRS may play a role in disease; (2) HTNV induced by CXCL10 through what way to signal generation. First, we collected the serum of HFRS patients, HFRS patients to detect the content of CXCL10 in serum, and analyze the relationship between the content and condition of CXCL10. Then the establishment of in vitro HTNV infection of primary endothelial cell model, explore the origin of CXCL, and studied in endothelial cells, the molecular mechanism of HTNV regulation of CXCL10. In this study, we found that the sharp increase in the expression of CXCL10 in sera of patients with HFRS, particularly significant during the acute phase of HFRS. Through correlation analysis, we found that white blood cell count CXCL10 and HFRS patients, serum creatinine and urea nitrogen were positively correlated, negatively correlated with platelet counts and plasma viral load in patients with high The level of CXCL10 is high. Then through the detection of peripheral blood HFRS lymphocyte subsets of CXCL10 receptor surface expression level of CXCR3, found in the acute phase of HFRS, monocyte surface CXCR3 increased sharply, suggesting that during the acute period, high level of CXCL10 may induce mononuclear cells to endothelial cells in vitro. We found that the primary endothelial cells after HTNV infection, the expression amount of cxcl10. and HTNV, not through the expression of viral proteins regulate CXCL10, but through the dsRNA structure, the RNA virus in the activation of TLR3, RIG-I and MDA-5 pathway, induced transcription factor nf- kappa B and IRF7 phosphorylation and nuclear translocation, start the sub area then nf- kappa B subunit P50 and p65 and IRF7 combined with CXCL10, the process of transcription regulation of CXCL10. These studies help us understand CXCL10 and participate in the "cytokine storm" in virus infection The clinical effect, can better provide a theoretical basis for the treatment of HFRS.Il-33 is a new member of IL-1 cytokine family, previous studies have shown that IL-33 is the ligand of ST2. The orphan receptor cells in a quiescent state or apoptosis, IL-33 can exist as a transcription factor and the nucleus, when cell necrosis, IL-33 can be released from cells. Therefore, IL-33 is considered to be the "alarm", as the danger associated molecular patterns (danger-associatedmolecularpattern, damp) family members, IL-33 can release warning immune system infection or injury. The study found that IL-33 can activate Th2 mediated immune response, promote Th2 related cytokines such as, IL-4, IL-5 and IL-13. In Th2 immune response mediated diseases, IL-33 endothelial cells and epithelial cells. The inflammatory reaction of.Il-33 receptor ST2 due to protein coding after shear All three proteins can form different shear different body, including membrane surface ST2L, soluble sst2., soluble sst2 membrane surface variant st2v and protein can be used as a decoy receptor for IL-33, IL-33 and ST2L combined with competition, physiological or pathological effects of.St2l and IL-33 can induce activation of il-33/st2l pathway and the combined ST2L and IL-1 receptor accessory protein (il-1raccessoryprotein, IL-1RAcP) to form a complex, raising MyD88, activation of MAPK and nf- kappa B pathway, promoting the release of inflammatory factors. Many studies reported the expression and role of il-33/st2 pathway in different diseases. In the airway inflammatory diseases, autoimmune diseases and virus infection the disease, the il-33/st2 pathway is involved in the damage process of pathological inflammation. However, in HFRS, il-33/st2 how to regulate the immune response remains unclear. In the second part of this paper, we will address the following Two questions: (1) il-33/st2 how to play the role of immunoregulation in HFRS; (2) the molecular mechanism of synergistic effect of endothelial cells induced by inflammatory reaction of il-33/st2 and HTNV infection. First, we collected plasma from patients with HFRS, IL-33 and sst2 were detected in plasma, and analyze the correlation between the disease and the two in patients with HFRS. Subsequently, in endothelial cells in vitro model of HTNV infection, regulation of detection of il-33/st2 inflammation on endothelial cells. Finally, application of HTNV infection in vitro endothelial cell model to explore the molecular mechanism of synergistic regulation of inflammation in endothelial cells il-33/st2 and HTNV infection. In this study, we found that IL-33 and sst2 were high decoy receptor the expression of HFRS in plasma. Through correlation analysis found that IL-33 and sst2 and the severity of the disease was positively correlated, and between the two were also positively correlated with. Later, we in the body HTNV infection was found in endothelial cell model, IL-33 pathway mediated by ST2 promote the production of proinflammatory cytokines of HTNV infected endothelial cells caused by "cytokine storm, promote endothelial cell inflammation. Sst2 can inhibit endothelial cell inflammation. Moreover, IL-33 and HTNV by CO activation of nf- kappa B pathway to synergistically promote inflammatory reaction. The study suggests that IL-33 may be induced by HTNV infection induced by cytokines and the process of the storm", the inflammatory reaction can be inhibited by sST2.IL-33/ST2 regulating immune response after HTNV infection control, provides a new way for the treatment of HFRS.

【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.8

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