乳香树脂提取物对日本血吸虫感染小鼠肝脏肉芽肿和纤维化的抑制作用及其机制

发布时间：2018-02-24 02:38

本文关键词： 乳香树脂提取物日本血吸虫肝肉芽肿肝纤维化 NF-κB　出处：《安徽医科大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：血吸虫病依然是我国亟待解决的一个重要的公共卫生问题，该病主要死因是肝脏虫卵肉芽肿及其继发的肝纤维化，血吸虫肝肉芽肿和纤维化是血吸虫虫卵分泌SEA诱导免疫炎症反应的病理结果。化疗对已形成的虫卵或纤维化已无能为力。乳香树脂提取物（extracts of the oleogum resin from Boswellia serrate，BSE）有抗炎和免疫调节作用，已被用于治疗炎症性结肠炎、胶原诱导性关节炎、骨性关节病等一些炎症和免疫性疾病的临床前期试验，并取得良好的效果，且副作用小。现有研究显示乳香酸可以通过抑制IκB激酶（IKK）的活性而调控NF-κB的信号传导。迄今为止，BSE对血吸虫肝脏肉芽肿及纤维化的治疗作用未见文献报道，因此，本实验首先观察乳香树脂提取物抑制血吸虫虫卵肉芽肿和纤维化的作用，再分别从细胞和分子水平初步分析了BSE对血吸虫肝脏肉芽肿及纤维化的治疗作用机理，为控制血吸虫虫卵肉芽肿和肝纤维化提供理论和实验依据。本研究分为2个部分：一、乳香树脂提取物对日本血吸虫感染小鼠肝脏肉芽肿的抑制作用及其机制；二、乳香树脂提取物对日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化的抑制作用及其机制。一、乳香树脂提取物对日本血吸虫感染小鼠肝脏肉芽肿的作用及其机制利用20条日本血吸虫尾蚴感染C57/BL6小鼠制备肝虫卵肉芽肿动物模型，实验动物共分5组： BSE-CD（280mg/kg）组，BSE-CD（140mg/kg）组，环糊精（cyclodextrin，CD，280mg/kg）组，模型对照组（infected mice)和正常对照组（normalmice）。针对小鼠肝肉芽肿模型，我们在感染后4周用不同剂量的BSE或者环糊精经腹腔注射治疗，每天1次，共3周，最后一次治疗后24h处死小鼠。然后检测BSE-CD治疗对感染血吸虫C57BL/6小鼠的肉芽肿炎症反应及肝脏损伤的影响。采用EMSA和免疫组化技术检测BSE-CD治疗对小鼠肝组织IKK-NF-κB信号通路的影响；RT-qPCR法分析BSE-CD治疗对小鼠肝组织炎性细胞因子mRNA表达水平的影响；最后利用ELISA、RT-qPCR和Western bolt检测BSE-CD治疗对小鼠MMP-9、LTB4和PGE2的表达的影响。结果表明：肉眼可见BSE-CD（280mg/kg）处理组小鼠肝脏的肉芽肿炎症反应明显减轻；HE染色的肝脏病理切片显示BSE-CD（280mg/kg）治疗后，肝脏肉芽肿面积显著小于模型对照组和环糊精组（P 0.05）；肝细胞坏死明显减轻，血清中转氨酶（AST/ALT）水平也相应显著下降（P 0.05）；而BSE-CD治疗对感染小鼠的虫荷、卵荷、没有明显影响（P0.05）；利用磷酸化IκB激酶（IKK）抗体通过免疫组化检测磷酸化的IKK，发现BSE-CD（280mg/kg）组小鼠肉芽肿周围炎症细胞磷酸化的IKK明显减少（P 0.05），证实BSE-CD（280mg/kg）可抑制IKK的磷酸化；凝胶迁移迁移率实验（EMSA）显示BSE-CD（280mg/kg）治疗组小鼠肝脏组织中NF-κB活性显著下调（P 0.05）；定量PCR结果证实BSE-CD（280mg/kg）组肝组织的MCP-1、TNF-α和VEGF的mRNA水平显著下调（P 0.05），IL-1β、IL-6的mRNA均值也低于模型对照组和环糊精组，但两组之间的差别无统计学差异，但BSE-CD治疗对IL-13和TGF-β的mRNA水平无影响；Western bolt和定量PCR结果证实证实BSE-CD（280mg/kg）和BSE-CD（140mg/kg）治疗均可显著下调肝组织MMP-9的基因和蛋白表达水平（P 0.05）； ELISA法检测证实BSE-CD（280mg/kg）治疗可下调LTB4和PGE2的表达（P 0.05）。总之，BSE-CD早期干预可以减轻血吸虫感染小鼠的急性期肝脏肉芽肿病变，减轻肝细胞坏死，同时伴有抑制NF-κB的信号传导，下调肝组织MCP-1、TNF-α和VEGF的表达，进一步证实BSE-CD治疗可下调MMP-9、LTB4和PGE2的表达。故BSE-CD抑制肝肉芽肿的机制之一是通过抑制IKK的活性而下调NF-κB的信号传导，下调MCP-1、TNF-α和VEGF的表达；同时还与BSE-CD抑制一些生化介质，如MMP-9、LTB4和PGE2的表达相关。二、乳香树脂提取物对日本血吸虫感染小鼠肝脏纤维化的作用及其机制利用血吸虫尾蚴感染C57/BL6小鼠制备肝纤维化模型，实验动物共分5组：BSE-CD（280mg/kg）组，BSE-CD（140mg/kg）组，环糊精（cyclodextrin，CD，280mg/kg）组，，模型对照组（infected mice)和正常对照组（normal mice）。针对小鼠肝纤维化模型，并于感染后42天经胃灌吡喹酮(500mg/kg/d x2d），在感染后7周用同不同剂量的BSE或者环糊精经腹腔注射治疗，每天1次，共治疗21天，最后一次治疗后24h处死小鼠。肝脏组织切片Masson染色检测BSE-CD对感染血吸虫C57BL/6小鼠治疗后对肝纤维化的影响；检测血清肝纤维化指标透明质酸（hyaluronic acid， HA）和层粘连蛋白（laminin，LN）LN；采用免疫组化检测BSE-CD治疗对小鼠肝组织α-SMA的影响；RT-qPCR法分析BSE-CD治疗对小鼠肝组织炎症细胞因子mRNA表达水平的影响。体外培养肝星状细胞（hepatic stellatecells，HSC）-T6，采用MTT法检测BSE-CD对的HSC-T6增殖作用，Hoechst33258染色和流式细胞术检测BSE-CD对活化HSC-T6凋亡形态和凋亡率的影响。结果表明：Masson染色证实BSE-CD（280mg/kg）治疗组肝脏纤维化的面积明显减少（P 0.05）；BSE-CD（280mg/kg）治疗对血清中HA和LN没有影响（(P0.05）；免疫组织化学结果提示：BSE-CD（280mg/kg）组小鼠肝脏α-SMA表达面积较模型对照组和环糊精组下降32.3%（P 0.05）；定量PCR结果证实BSE-CD（280mg/kg）组肝组织的MCP-1、TNF-α和VEGF mRNA水平显著下调（P 0.05），IL-1β、IL-6的mRNA均值也低于模型对照组和环糊精组，但两组之间的差别无统计学差异，但BSE-CD治疗对IL-13和TGF-β的mRNA水平无影响。体外实验结果表明BSE-CD（0.25-0.2mg/ml）能显著抑制HSC-T6细胞的增殖，并呈一定的量效关系； Hoechst33258染色和流式细胞术证实BSE-CD （0.25-0.2mg/ml）作用HSC-T648h能诱导HSC-T6凋亡，同对照组相比，凋亡率显著增加（P 0.05）。总之，BSE-CD晚期治疗可以缓解血吸虫感染小鼠肝脏纤维化病变，同时伴有下调肝组织MCP-1、TNF-α和VEGF的表达；体外实验进一步研究发现BSE可抑制HSC的增殖和诱导HSC凋亡。故BSE-CD抑制肝纤维化的机制之一是通过下调NF-κB的信号传导，下调MCP-1、TNF-α和VEGF的表达，减轻对HSC的激活。BSE对肝纤维化的治疗作用机制还与其抑制HSC的增殖和诱导活化的HSC凋亡相关。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R532.21;R392

【参考文献】