分枝杆菌丝氨酸乙酰基转移酶的功能与结构研究

发布时间：2018-03-07 00:05

  本文选题：分枝杆菌　切入点：丝氨酸乙酰基转移酶　出处：《大连医科大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：由结核分枝杆菌引起的结核病仍然是目前危害人类健康的慢性传染病。由于结核分枝杆菌的多耐药性和广耐药性，加之与艾滋病毒的互作，使得结核病的发病率和死亡率不断地增加，因此研发新的抗结核的药物迫在眉睫。L-半胱氨酸(L-cys)是重要的含硫氨基酸，参与L-蛋氨酸、二级代谢物、辅酶A等含硫化合物的生物合成。微生物的半胱氨酸合成由丝氨酸经过丝氨酸乙酰基转移酶(SAT/CysE)转化为氧乙酰丝氨酸，再在氧乙酰丝氨酸硫解酶的作用下，，最终转化为半胱氨酸。丝氨酸乙酰基转移酶参与半胱氨酸合成的第一步反应，将丝氨酸最终转化为半胱氨酸。这条合成半胱氨酸的途径仅存在于植物和微生物中，与人体中合成半胱氨酸的途径完全不同。因此，丝氨酸乙酰基转移酶是抗结核分枝杆菌的一个潜在的药物靶点。 本论文的目的：(1)确定耻垢分枝杆菌中表达丝氨酸乙酰基转移酶的基因，确认其丝氨酸乙酰基转移酶的功能。研究敲除丝氨酸乙酰基转移酶的基因后对耻垢分枝杆菌的生长及代谢的影响，以确定它的抗结核药物靶点的特性，同时寻找更多的潜在的药物作用的靶点。(2)通过点突变了解乙酰基转移酶的空间结构与功能的关系，确定结核分枝杆菌的丝氨酸乙酰转移酶活性位点。通过优化结核分枝杆菌的丝氨酸乙酰基转移酶的表达及了解酶学特征，为建立高通量筛选酶抑制剂的模型及定向设计酶抑制剂提供理论依据。 本论文的方法和结果如下： 1.耻垢分枝杆菌基因MSMEG_5947的克隆表达以及活性测定。 PCR扩增基因MSMEG_5947，构建克隆载体pMD18-MSMEG_5947。DNA序列测定正确后构建用于表达的载体pET16-MSMEG_5947和pCold-MSMEG_5947，将其转化到表达菌株BL21(DE3)中。SDS-PAGE和蛋白质印迹检测MSMEG_5947蛋白表达。Ni-NTA-Agarose亲和层析柱纯化在大肠杆菌中过表达的目的蛋白。SDS-PAGE和Western blotting检测到了纯化的MSMEG_5947蛋白。DTNB (Ellman)法检测到了表达的蛋白的丝氨酸乙酰基转移酶的活性。 2..耻垢分枝杆菌基因MSMEG_5947敲除菌株的构建以及基因缺失后的影响 (1) MSMEG_5947基因敲除菌株的构建 PCR扩增基因MSMEG_5947基因及其上游约696bp的DNA序列，并将其克隆到pMD18-T上，测序后的序列与耻垢分枝杆菌基因组上MSMEG_5947基因序列完全一致的阳性质粒用于下面的实验。将来自于质粒pUC4K的KanR的片段克隆到MSMEG_5947基因内，产生MSMEG_5947::KanR突变基因。将MSMEG_5947::KanR突变基因克隆到质粒pPR27-xylE，构建了条件性复制质粒pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR。 PCR扩增cysE基因，并将其克隆到pMD18-T上，测序正确后将它连接到pET23b质粒上，再连同该质粒上的启动子一起连接到质粒营救质粒pCG76。构建了营救质粒pCG76-Phsp60-cysE。 将条件复制性质粒pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR电转化到耻垢分枝杆菌中。在42C条件下迫使pPR27-xylE-MSMEG_5947::KanR质粒中的MSMEG_5947::KanR与耻垢分枝杆菌的基因组中的MSMEG_5947发生同源重组， MSMEG_5947::KanR以及sacB基因、xylE基因整合到基因组中。Southern印迹和PCR的方法分析筛选出了发生第一次同源重组的菌株（mc2155MSMEG_5947SOC-1）。 营救质粒转化到mc2155MSMEG_5947SOC-1中，在30C条件下，用10%蔗糖的压力选择培养转化的mc2155MSMEG_5947SCO-1，在这种选择压力下，mc2155MSMEG_5947SCO-1基因组中的MSMEG_5947::KanR与MSMEG_5947发生第二次同源重组，将MSMEG_5947基因、sacB基因以及xylE基因从mc2155MSMEG_5947SCO-1基因组中删除掉只留下MSMEG_5947::KanR。用Southern印迹和PCR方法筛选出MSMEG_5947基因敲除菌株(SM-ΔM_5947stain)。 (2) MSMEG_5947基因敲除菌株的生长曲线 MSMEG_5947基因敲除菌株在每间隔24小时测定30C和42C条件下的OD600nm的值，绘制敲除菌株的生长曲线。相比于野生型菌株，敲除菌株的生长在30C的条件下没有变化。在42C的条件下，基因敲除菌株的生长相比于野生型的菌株有滞缓。因而说明了MSMEG_5947基因对分枝杆菌生长有影响。 (3) MSMEG_5947基因敲除菌株的电镜观察 用扫描电镜和透射电镜观察MSMEG_5947基因敲除菌株在42C条件下培养后的形态的变化。相比于野生型的菌株，敲除菌株的形态在对数期发生了了明显的变化。菌体末端出现膨大，菌体内部出现了大量的空泡。因而MSMEG_5947基因对分枝杆菌的形态有影响， (4) MSMEG_5947基因敲除菌株的蛋白质组学的分析 用双向电泳分析基因敲除后的菌株相比与正常的菌株的蛋白质组学。利用Image J软件对斑点进行分析匹配，发现差异的蛋白点。MALDI-TOF质谱鉴定，在Matrix Science-Mascot数据库中查找比对，对每个差异点选出匹配度最高的蛋白。对结核分枝杆菌蛋白相应编码基因进行功能学分类，找到与结核分枝杆菌代谢有关的酶。 3.结核分枝杆菌丝氨酸乙酰基转移酶同源模型的建立 用一些生物信息学软件，例如ProtParam，Inter-ProScan, PSIPRED, NCBIConserved Domains Database和SWISS-MODEL等分析结核分枝杆菌丝氨酸乙酰基转移酶的一级结构，二级结构以及空间结构模型。 4.结核分枝杆菌丝氨酸乙酰基转移酶的表达，活性测定及动力学特性的分析 用pCold质粒优化表达结核分枝杆菌的丝氨酸乙酰基转移酶。HPLC和DTNB (Ellman)法测定丝氨酸乙酰基转移酶的活性。测定了该酶的最适反应条件和酶促动力学常数。丝氨酸乙酰基转移酶的比活度是10.66±0.44μmol/min/mg，最适反应温度是37C，最适pH是7.5。 5.结核分枝杆菌乙酰基转移酶氨基酸定点突变 利用反向PCR及分子克隆技术构建出3种pET29-cysE-M突变重组质粒，分别转化到BL21(DE3)中。蛋白质印迹分析表明突变蛋白可以表达，但是表达量不高。HPLC分析酶活性，突变体都具有丝氨酸乙酰基转移酶的活性，用DTNB分析酶活性变化，突变体的酶的活性相对于正常的酶的活性都有所降低。 结论： 1.耻垢分枝杆菌中丝氨酸乙酰基转移酶的基因确认为MSMEG_5947，但是是非必需的基因。 2.丝氨酸乙酰基转移酶的基因敲除后的蛋白质有差异。差异的蛋白与分枝杆菌的能量代谢和蛋白的合成有关。 3.结核分枝杆菌的丝氨酸乙酰基转移酶的结构预测可知，它具有一个保守的左手β螺旋是该酶活性有关的结构域。 4.丝氨酸乙酰基转移酶的67位天冬氨酸，82位的组氨酸，117位的组氨酸是与其活性有关的位点。 未来研究方向： 1.用双向电泳进一步的筛选和鉴定丝氨酸乙酰基转移酶基因敲除后的差异蛋白； 2.利用Real-Time PCR对耻垢分枝杆菌氨酸乙酰基转移酶基因敲除菌株的差异蛋白在转录水平的表达变化进行测定。 3.利用高通量筛选、定向设计抑制剂法寻找结核分枝杆菌的丝氨酸乙酰转移酶抑制剂。 4.测定CysE蛋白晶体结构，观察底物与酶蛋白的相互作用的机制 5.用基因的定点突变，筛选更多的与活性有关的位点，并研究发生突变的丝氨酸乙酰基转移酶的动力学特性，来确定活性位点的作用。
[Abstract]:Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis is still a chronic infectious disease to human health hazards. At present due to Mycobacterium tuberculosis multidrug resistance and wide resistance, coupled with the interaction of HIV, TB incidence and mortality rates continue to increase, so the development of new anti tuberculosis drugs (L-cys) is imminent.L- cysteine sulfur amino acid important, participate in the L- two levels of methionine, metabolites, biosynthesis of coenzyme A and other sulfur-containing compounds. The microbial synthesis of cysteine by serine by serine acetyltransferase (SAT/CysE) into o-acetyl-l-sedne, then solution enzyme in o-acetyl-l-sedne sulfur under the effect of final conversion to cysteine. Serine acetyltransferase involved in the first step reaction synthesis of cysteine, serine will eventually transformed into cysteine. Synthesis pathway that cysteine exists only in the In plants and microbes, the way to synthesize cysteine is completely different from human body. Therefore, serine acetyltransferase is a potential drug target against Mycobacterium tuberculosis.
The aim of this paper is: (1) to determine the expression of serine acetyltransferase gene of Mycobacterium smegmatis, confirm its serine acetyltransferase function. Study on the effects of knocking out the growth and metabolism of Mycobacterium smegmatis serine acetyltransferase gene, to determine the characteristics of its anti tuberculosis drug target, target and search the drug potentially more. (2) to understand the relationship between acetyltransfer spatial structure and function of the enzyme by point mutation, determine the Mycobacterium tuberculosis serine acetyltransferase acetyl serine active site of the enzyme. Through the optimization of Mycobacterium tuberculosis transferase expression and understanding enzymological characteristics, provide a theoretical basis for the design of enzyme inhibitors and directed model establishment of high-throughput screening enzyme inhibitors.
The methods and results of this paper are as follows:
Cloning and expression of 1. Mycobacterium scale Mycobacterium MSMEG_5947 and determination of its activity.
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本文编号：1577065