狂犬病实验室网络化监测技术的建立与应用

发布时间：2018-03-27 13:45

本文选题：狂犬病　切入点：狂犬病病毒属病毒　出处：《中国疾病预防控制中心》2016年博士论文

【摘要】：狂犬病(Rabies),是一种由狂犬病病毒属病毒(Lyssavirus, LYSSA)感染中枢神经系统而引起的高度致死性脑脊髓炎,是最早被人类所发现和认识的疾病之一。狂犬病以近乎100%的病死率成为全世界感染死亡率最高的疾病,在临床上主要表现为狂躁型和麻痹型两种。不同基因型别狂犬病病毒的致病性有所不同,在犬、猫等哺乳动物中主要传播和流行的狂犬病病毒通常为基因Ⅰ型的狂犬病病毒(Rabies virus, RABV), I临床表现以狂躁型为主；而在蝙蝠中传播的狂犬病病毒基因型别较多也较为复杂,但毒力相对较弱,一般出现麻痹型临床表现。LYSSA属于弹状病毒科成员之一,为不分节段的单股负链RNA病毒,全基因组长度约为12kb,病毒基因组从3’端到5’端依次编码有N、P、M、G和L共5种结构蛋白。目前,已确认LYSSA 7个基因型14种病毒,近几年又有一些新待定的LYSSA报道。本研究通过狂犬病实验室网络化监测核心技术的研究和探索,建立了LYSSA分子分型技术、狂犬病监测信息报告及数据管理系统和相关病毒实验室快速检测方法,从国家层面搭建了满足多部门、多机构狂犬病网络化实验室监测和科学技术研究任务所需的技术方法和信息传导及联动应用平台。通过初步应用,对我国狂犬病流行毒株的种群及地域分布进行了监测与分析,揭示了我国狂犬病流行株的种群划分情况及各种群地域分布特点：监测发现我国首例输入性实验室确诊狂犬病病例,并对其进行分子生物学特征分析与溯源分析：监测获得我国第一个北极相关群流行株的全基因组序列,并且对我国不同种群的基因组序列特征进行了系统的比较和分析。本研究为进一步提升我国狂犬病实验室网络化监测能力提供了重要技术保障,相关应用及分析揭示我国狂犬病流行与传播的内在规律,为科学预警与防控提供科学依据。第一章：狂犬病实验室网络化监测技术的建立本研究首先从我国狂犬病疫情流行情况入手,通过对2013年中国狂犬病流行特征的分析,进一步明确我国狂犬病的流行特征和分布特点。2013年我国狂犬病疫情总体呈现下降趋势,这是我国狂犬病在2007年达到新流行期顶峰后,连续第6个疫情下降的年份。我国狂犬病病例绝大多数发生在农村地区,流行与地域存在紧密联系,报告病例仍然主要分布在长江以南的省区,虽然与近年监测的疫情分布状况近似,但与长江以北地区的差距呈持续减小趋势,疫情地域蔓延趋势异常明显,疫情呈现由南向北,由高发向低发的不断转移,我们应对此现象给予足够的警惕和重视。为提高狂犬病实验室监测能力,针对狂犬病病毒属各不同基因型病毒,利用PCR和基因测序技术,成功建立LYSSA巢式RT-PCR检测体系、LYSSA全基因组测序体系、LYSSA基因型快速鉴定方法及分型标准；利用计算机软件开发技术,建立基于现代网络的狂犬病监测信息报告及数据管理系统,同时建立了多部门共享的人与动物狂犬病相关的流行病学数据库、病原学数据库和基因数据库,为进一步提高狂犬病实验室网络化监测能力提供坚实的技术保障。第二章：狂犬病实验室网络化监测平台的应用通过本研究所建立的狂犬病实验室网络化监测技术平台,首先对我国狂犬病流行毒株的种群及地域分布进行监测与分析,完成标本收集与检测、序列测定和同源性比较及种系发生分析,涉及标本8441份(384份阳性),分别来自人、犬、猫、鼬獾、鼠和牛等宿主。对截至目前几乎所有的具有明确背景信息的中国狂犬病病毒N基因序列进行下载整理后结合新测的序列,共452个流行株的序列进行种系发生分析,覆盖全国26个省区,时间跨度47年(1969年-2015年)。结果显示,我国狂犬病病毒可以分为China I-VI共6个毒株群,China I群仍然是目前我国狂犬病流行的最优势毒株群,分布范围不仅贯穿南部,而且已经扩散到西部的甘肃和宁夏,引发当地平静多年后新的狂犬病流行,中部北部省区近年疫情上升期分离到的毒株也都属于C hina I群,照此趋势,China I群的扩散还会继续向鲜有狂犬病病例报告的西部和东北部省区扩散,引发当地疫情的上升；除了China I群以外,China II群也是分布范围广、毒株数量较多的种群,本研究汇总China II群的分布范围已扩展到14个省区,说明近年在数量和分布范围上都在增长,China II群和China I群都是以犬为主要传播宿主的种群,但分布于浙江、江西等地的野生动物鼬獾的毒株却绝大部分属于China II群,极个别毒株属于China I群,说明两者宿主种类上分布的差异：China III群的数量虽然远低于China I群和China II群,但分布范围比之前了解的大了很多,已扩展至9个省区,而且新疆、内蒙古的牛、羊、骆驼等均属于China III群,China III群是参与世界范围循环的毒株群,新疆、内蒙古的毒株还跟蒙古国、俄罗斯等国家的野生动物毒株亲缘关系较近；十几年甚至二十多年没有人狂犬病病例报告的青海和西藏分别于2012年和2015年开始报告狂犬病病例,其流行株归属于此前只在我国内蒙古极少量发现的China IV群；China V群仍然只包括上世纪90年代初期之前的毒株,没有参与1996年之后的第三个疫情流行高峰；China VI群仍局限在我国云南和广西地区。监测发现我国首例输入性实验室确诊狂犬病病例,并测定病毒N基因序列,通过系统进化分析显示,中国目前流行的6个毒株群(ChinaI-VI)中,只在内蒙古等省区小范围循环的China IV群与该病例属于同一大分支,但又有较大差异；与国际毒株比较发现,该病例与印度毒株I_141以及RV61等毒株亲缘关系较近,属于Arctic-like-1群,是主要分布于中东和南亚的一支北极相关毒株群;病例在北京发病前曾在印度被猴子咬伤,种系发生分析证实其传染源的确是印度野生动物,进一步证实该病例为狂犬病输入病例。监测获得我国第一个北极相关群流行株的全基因组序列,并且对我国不同种群的基因组序列特征进行了系统的比较和分析。第三章：相关病毒实验室快速检测方法的建立为进一步提高我国应对新发传染病的综合防控能力,实现2小时内病原快速甄别,同时建立了LYSSA相关病毒的实验室快速检测方法。建立完成针对Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)的TaqMan PCR检测方法,引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测Ct值的变异系数均小于1.7%,定量分析模型灵敏度达到100 copies/PCR。建立完成针对Tahyna病毒(Tahyna virus, TAHV)的实时荧光定量PCR检测方法,具有良好的灵敏性、特异性和稳定性,同一样品重复检测Ct值的变异系数均小于5%,定量分析模型灵敏度达到10 copies/PCR。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.99

【参考文献】