弓形虫感染的血清流行病学调查及部分抗原的免疫学研究

发布时间：2018-03-29 12:26

本文选题：弓形虫　切入点：血清阳性率　出处：《吉林大学》2013年博士论文

【摘要】：弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，其宿主范围极为广泛，可引起人畜共患寄生虫病，据统计，全球约有三分之一人口感染弓形虫，各地流行情况从10~70%不等，并且温暖潮湿地区的流行率较其他地区稍高。在不同地区，弓形虫还表现出明显的遗传多样性，亦有报道证实在我国同样存在高度的弓形虫基因多样性，，中国人实际的弓形虫感染状况远比想象中更复杂，而且弓形虫抗原存在多源性、期特异性、株特异性及变异性等特点，所以，同时结合多种敏感有效抗原进行感染诊断及流行病学调查就显得十分必要。目前，弓形体病的诊断主要通过检测血清样本中特异性IgG和IgM抗体，而绝大多数商业试剂盒所采用的都是从弓形虫速殖子分离得到的全虫可溶性抗原，由于抗原制备质量的差异，很可能影响检测结果的可靠性。而重组抗原具有均质稳定、方便易得的特点，有望作为一种新型诊断制剂，但其可靠性仍需要大量研究来证实。另外，弓形虫在免疫正常者体内常以缓殖子的休眠状态存在，当宿主免疫系统受损时，缓殖子可转换成迅速繁殖的速殖子，速殖子和缓殖子展现不同的抗原全貌，因而如果将强毒株抗原、弱毒株抗原、缓殖子期抗原与速殖子期抗原联合起来用于弓形虫病诊断，则可以更全面、更准确地反映人群弓形虫感染情况，并且这对寻求弓形虫生活史各阶段的诊断抗原以及开发研制诊断试剂和疫苗都有重要意义。本研究首先利用基因工程技术构建重组表达质粒，通过亲和层析方法纯化得到12种重组抗原，分别为SAG1-His、SRS4-His、BAG1-His、SRS8-His、SUS1-His、GRA5-His、SRS9-His、SAG3-His、MIC6-GST、SAG5D-GST、BSR4-GST和SAG5D-GST，经SDS-PAGE和Western blot鉴定，所有蛋白质分子量均符合预期大小且纯度达到实验要求。并且可与弓形虫感染大鼠高免血清以及弓形虫感染人血清作用，表明其对血清的识别能力较强，其次，以纯化的重组蛋白质作为包被抗原对880份健康人血清样本进行间接ELISA检测，通过对每种重组抗原单独的血清阳性率、来源于不同虫株和不同发育阶段抗原的阳性率以及检测结果间的交叉情况进行比较，结果显示，阳性血清总计248例，各抗原总阳性率28.2%；这比以往国内外所报道的弓形虫感染率都高。另外，在共计248例阳性反应的样本中，三类重组抗原检测的阳性结果之间存在很高的一致性。显然，这是因为我们所使用的抗原为强毒株、弱毒株抗原联合速殖子、缓殖子抗原，而以往流行病学调查中，大部分所使用的抗原都是来源于国际标准强毒株RH株的全虫裂解抗原，又或者是本地分离株产生的抗原。尽管弓形虫只有一个种即刚地种，但有报道称不同国家地区都有不同的弓形虫分离株，而且各分离株的生理生化特性和对宿主的免疫应答反应都有很大差别。目前使用的多数检测方法所能覆盖的范围要比估计的小，所以采用一种更敏感更特异的免疫学方法对弓形虫不同虫株进行检测十分必要。另一方面，最新研究表明Mindin是一种高度保守的分泌型细胞外基质(ECM)蛋白，在先天性免疫应答中起着关键作用，可作为一种模式识别分子参与天然免疫，加强免疫系统对病原体的识别清除作用。它还可发挥调理素的功能，介导巨噬细胞对病原微生物的吞噬作用，启动内源性免疫应答抵御细菌和病毒。鉴于Mindin在识别病原体微生物方面的这种特殊作用，能有效地结合病原体并协助巨噬细胞将其清除，通过炎性反应和非特异性增强反应，激活免疫活性细胞，因而其有望作为一类新型免疫增强剂分子用于抗感染免疫和临床研究。在本研究中，我们选取在血清IgG抗体检测中阳性率较高的3种重组抗原rBAG1、rSRS4和rSRS9，分别与弗氏佐剂、Mindin和PBS混合免疫接种Balb/c小鼠，通过分析不同佐剂组所诱导的抗体应答反应、抗体动态变化、淋巴细胞增殖情况及攻虫后小鼠的存活情况，探讨其对小鼠的免疫保护效果以及Mindin作为一种新型生物源性佐剂的增强效果。结果显示，与PBS对照组相比，弗氏佐剂与Mindin免疫组小鼠均产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，而且三种抗原的特异性抗体均保持较高水平，持续时间较长；抗体亚型分析显示弗氏佐剂主要以Th1型反应为主，而Mindin却是诱导混合型Th1/Th2反应。淋巴细胞增殖实验显示弗氏佐剂组、Mindin佐剂组都具有较高的刺激指数和增长指数。另外，三种抗原也有望作为弓形虫疫苗候选抗原进行深入研究。目前，联合疫苗在免疫预防中已成为一个十分有前景的疫苗研究方向，如若能将弓形虫强/弱毒株、速/缓殖子期的抗原联合用于免疫保护研究，则可能对宿主产生更好的保护效果。
[Abstract]:Toxoplasma gondii is a kind of specific intracellular parasite , its host range is very wide , it can cause parasitic diseases of human and livestock . The infection diagnosis and epidemiological investigation of toxoplasmosis are more complicated .

In this study , the recombinant expression plasmid was constructed by using genetic engineering technique , and 12 kinds of recombinant antigens were purified by affinity chromatography . The results showed that all the molecular weights of SAG1 - His , SRS4 - His , BSR4 - His , GRA5 - His , SRS9 - His , SAG3 - His , MIC6 - GST , SRS9 - His , SAG3 - His , MIC6 - GST , SAG5D - GST , BSR4 - GST and SAG5D - GST were determined by SDS - PAGE and Western blot .
In addition , there is a high degree of consistency between the positive results of three types of recombinant antigens in a total of 248 positive reactions . It is clear that most of the antigens used are the virulent strains , the weak strain antigen , the tachyzoite and the slow zoite antigen . In the past epidemiological investigation , most of the antigens used are different from the standard virulent strains of RH strain . However , most of the antigens used in the previous epidemiological investigation have different physiological and biochemical characteristics and immune response to the host .

In this study , we have selected three recombinant antigens rB1 , rSRS4 and rSRS9 which are highly conserved and play a key role in innate immune response .
In addition , three antigens are expected to be used as vaccine candidate antigens for toxoplasmosis . In addition , three antigens are expected to be used as candidate antigens for toxoplasmosis .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R531.8

【共引文献】