慢性丙型肝炎个体化治疗策略及免疫调节机制的研究

发布时间：2018-04-02 02:41

本文选题：慢性丙型肝炎　切入点：干扰素　出处：《河北医科大学》2013年博士论文

【摘要】：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染呈全球性流行，感染人数达1.8亿，我国HCV抗体阳性率约为3.2%。HCV感染后50%~80%发展为慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），感染HCV20年后，肝硬化的年发生率为10%~15%，一旦发展为肝硬化，每年肝癌的发生率为1%~7%，严重危害人类健康。干扰素（interferon，IFN）联合利巴韦林（ribavirin，RBV）为目前国际公认的有效抗HCV方案，标准疗程（HCV基因2型、3型丙肝患者治疗24周，基因1型患者治疗48周）治疗基因2型、3型获得持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）率为55%~60%，基因1型为CHC难治的因素之一，SVR率仅为38%~41%。我国HCV感染以中老年患者居多，部分患者已进展为肝硬化或合并其他系统疾病，而且，，因为干扰素及利巴韦林治疗的副作用，临床上约有30~40%的CHC患者不能耐受标准治疗方案而延误治疗，导致病情的进展，因此，亟待探索适于不同人群的CHC个体化治疗方案。宿主固有免疫和获得性免疫状态与慢性HCV感染及抗病毒治疗应答相关，尤其治疗前后细胞免疫功能的变化是影响治疗后早期及持续病毒学应答的重要因素。外周血单核细胞及T淋巴细胞免疫分子表达水平的观察可能有助于抗病毒治疗方案的优化，主要包括正向免疫调节因子单核细胞Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）的表达，负向免疫调节因子T细胞程序性死亡受体-1（programmed death-1，PD-1）的表达以及负向免疫调节细胞调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的比率变化。另外，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucindomain-3，Tim-3）/半乳糖凝集素-9（Galectin-9，Gal-9）系统也在HCV感染过程中发挥重要的免疫抑制作用。探明免疫分子变化趋势及其调节机制将有助于预测慢性HCV感染的抗病毒治疗应答及预后。我们结合我国慢性丙型肝炎发病特点及免疫状况，探讨适于不同人群的个体化治疗方案，并通过观察治疗前后细胞免疫功能的变化和体外细胞培养及干预实验，明确干扰素治疗前、治疗中相关免疫指标变化与治疗效果的关系，为CHC免疫调节疗法的的研发提供理论依据。第一部分慢性丙型肝炎个体化抗病毒方案的临床研究目的：探讨适于中国人群慢性HCV感染的个体化抗病毒治疗方案，改善患者依从性、提高临床治愈率。方法：采用前瞻、开放性临床研究，选择2010年1月～2012年12月在河北医科大学第三医院、石家庄市第五医院、中国人民解放军白求恩国际和平医院、邢台市人民医院、邯郸市传染病医院住院CHC患者280例，记录患者感染途径。根据患者年龄（65岁或≥65岁）、体重（60kg或≥60kg）、合并疾病状态（是否有肝硬化、糖尿病、心脏疾病、甲状腺疾病等）及患者经济承受能力选择不同剂量、类型干扰素联合利巴韦林治疗的个体化方案。研究包括IFNα-2b和PegIFNα-2a组，每组根据应用干扰素剂量又分为小剂量组和常规剂量组，根据治疗过程中完全病毒学应答时间确定疗程。对比分析不同治疗方案病毒学应答率和不良反应发生情况，以及HCV基因型与病毒学应答的关系。结果：输血/血制品感染者203例（72.5%），30例（10.7%）为其他途径感染包括手术/外伤、拔牙、针灸或内镜检查等侵袭性操作、穿耳洞等，47例（16.8%）感染途径不明。IFNα-2b组（n=171）快速病毒学应答（rapid virological response，RVR）、完全早期病毒学应答（complete earlyvirological response，cEVR）、持续病毒学应答（sustained virologicalresponse，SVR）和不良反应率依次为52.0%，71.3%、57.9%和7.0%，PegIFNα-2a组（n=109）为69.7%、89.9%、74.1%和8.3%，PegIFNα-2a组RVR、cEVR率显著高于IFNα-2b组（P 0.01）。IFNα-2b小剂量组（n=68）RVR、cEVR、SVR和不良反应率分别为44.1%、69.1%、57.1%和10.3%，IFNα-2b常规剂量组（n=103）分别为57.3%、72.8%、60.0%和4.9%，两组比较差异均无统计学意义（P0.05）。PegIFNα-2a小剂量组（n=48）RVR、cEVR、SVR和不良反应率分别为66.7%、85.4%、68.8%和12.5%，在PegIFNα-2a常规剂量组（n=61）分别为72.1%、93.4%、81.8%和4.9%，两组比较差异均无统计学意义（P0.05）。发生代偿期肝硬化CHC患者（n=16）RVR、cEVR和不良反应发生率分别为31.3%、81.3%和6.3%，未发展为肝硬化患者（n=264）分别为60.6%、78.4%和7.6%，其RVR率显著高于代偿期肝硬化患者（P 0.05）。146例进行HCV基因型检测的CHC患者中，1b型占62.3%。HCV基因1型感染者RVR、cEVR和不良反应发生率分别为53.2%、71.6%和8.3%，非HCV基因1型感染者分别为86.5%、83.8%和8.1%，非HCV基因1型感染者获得RVR率显著高于HCV基因1型感染者（P 0.001）。结论：根据CHC患者基线特征、合并基础疾病情况及治疗过程中病毒学应答出现时间制定个体化治疗方案，可提高患者耐受性和依从性，获得较高病毒学应答率，改善预后。第二部分Tregs及表达PD-1、TLRs细胞亚群与慢性HCV感染及治疗应答关系的研究目的：探明CHC患者干扰素治疗前、治疗过程中外周血细胞不同细胞亚群免疫相关分子的表达变化及其与病毒学应答的关系。方法：选择18～65岁CHC患者70例，IFNα-2b联合利巴韦林（IFNα-2b/RBV）治疗者37例， PegIFNα-2a联合利巴韦林（PegIFNα-2a/RBV）治疗者33例，疗程48~72周。另选择性别、年龄与CHC患者匹配的健康体检者20例作为对照组。采用流式细胞术检测对照组及CHC患者不同治疗组在治疗前、治疗第12、24、48周时外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞、表达PD-1的CD4+和CD8+T细胞、表达TLR2、TLR3、TLR4的CD14+单核细胞比率变化，并分析其与cEVR的关系。结果：CHC患者外周血基线Treg细胞（P 0.05），表达PD-1CD4+T细胞（P 0.05）、表达PD-1CD8+T细胞（P 0.01），表达TLR2（P 0.05）、TLR3（P 0.001）、TLR4（P 0.05）CD14+单核细胞比率均显著高于对照组；IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治疗12周时，Treg细胞和表达PD-1CD8+T细胞比率较基线显著降低（P 0.05），治疗24周时表达PD-1CD8+T细胞的比率较12周进一步下降（P 0.05），治疗48周时，表达PD-1CD4+T细胞比率较前显著下降（P 0.01）；IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治疗12周时表达TLR2、TLR3、TLR4CD14+单核细胞比率较基线显著升高（P 0.05），治疗24、48周后降至基线水平。73.5%（25/34）的IFNα-2b/RBV治疗患者获得了cEVR；78.1%（25/32）的PegIFNα-2a/RBV治疗患者获得了cEVR。多因素分析结果显示，基线时较低水平的表达TLR3CD14+单核细胞比率为获得cEVR的独立预测因素（OR=2.11，95%CI：1.15-3.88，P 0.05）。获得cEVR的CHC患者较未获得cEVR者在抗病毒治疗前表现为更低水平的表达TLR3CD14+单核细胞（P 0.05）和表达TLR4CD14+单核细胞比率（P 0.05），在治疗12周时较未获得cEVR者表现为更低水平的Treg细胞（P 0.01）、表达PD-1CD4+T细胞（P 0.01）和表达PD-1CD8+T细胞比率（P 0.05）。结论：基线时外周血低水平的表达TLR3CD14+单核细胞比率为CHC患者抗病毒治疗获得cEVR的预测因素；干扰素联合利巴韦林治疗可通过下调外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞、表达PD-1CD4+T细胞、CD8+T细胞比率和上调表达TLR2、TLR3、TLR4CD14+单核细胞的比率协同抗病毒作用，使患者获得早期病毒学应答，为治疗CHC提供新的免疫靶点。第三部分Tim-3/Gal-9通路在慢性丙型肝炎病毒感染中免疫调节作用的研究目的：探明Tim-3/Gal-9通路在慢性HCV感染中的作用及其调节细胞免疫功能的机制。方法：选择18～65岁CHC患者40例，并选择性别、年龄匹配的健康体检者20例作为对照组，采用酶联免疫吸附试验（enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA）方法检测对照组和CHC患者治疗前、治疗第12、24、48周及治疗结束后随访24周血浆Gal-9、白细胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）水平。选择CHC患者和健康对照各15例，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）进行体外培养，给予Tim-3阻断剂联合TLR4激动剂脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）或TLR3激动剂聚肌胞苷酸[Polyinosinic: polycytidylic acid，Poly(I:C)]干预。所分离PBMC分为5组：空白组（Control）：不予任何干预；TLR4激动剂组（LPS）：加入LPS培养；Tim-3阻断剂+TLR4激动剂组（Anti-Tim-3+LPS）：先加入Anti-Tim-3抗体培养30min后再加入LPS培养；TLR3激动剂组[Poly(I:C)]：加入Poly(I:C)培养；Tim-3阻断剂+TLR3激动剂组[Anti-Tim-3+Poly(I:C)]：加入Anti-Tim-3抗体培养30min后加入Poly(I:C)培养。细胞共培养24h，分离细胞培养上清液，ELISA法检测IL-12、IFN-α和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）表达水平；实时荧光定量PCR检测培养细胞2’-5’寡腺苷酸合成酶（2’-5’oligoadenylate synthetase，2’-5’OAS）、粘病毒抗性蛋白A（myxovirusresistance protein A，MxA）和细胞因子信号传导抑制蛋白1（suppressor ofcytokine1，SOCS1）mRNA表达水平。结果：CHC患者血浆Gal-9水平显著高于对照组（P 0.05），抗病毒治疗第12、24、48周Gal-9含量均较基线水平显著降低（P 0.05），治疗后随访24周时与基线水平差异无统计学意义（P0.05），治疗过程中不同时间点Gal-9血浆水平差异无统计学意义（P0.05）；获得cEVR与未获得cEVR、获得SVR与未获得SVR患者Gal-9水平差异均无统计学意义（P0.05）。CHC患者基线IL-12血浆水平与对照组无显著差异（P0.05），治疗12周时显著高于对照组（P 0.05）和基线水平（P 0.01），治疗24、48周及治疗结束后随访24周时与基线水平比较无显著差异（P0.05）；获得cEVR与未获得cEVR、获得SVR与未获得SVR患者相比，IL-12水平均无显著差异（P0.05）。健康对照与CHC患者各组PBMC培养上清中IL-12含量均较低，组间比较差异均无统计学意义（P0.05）。健康对照与CHC患者培养细胞抗病毒因子IFN-α、2’-5’OAS及MxA表达均为干预组显著高于空白组（P 0.05）；除Anti-Tim-3+Poly(I:C)组外，炎症因子TNF-α及免疫抑制因子SOCS1表达均为干预组显著高于空白组（P 0.05）。Anti-Tim-3+LPS组2’-5’OAS和MxAmRNA表达较单用LPS干预组显著升高（P 0.05），SOCS1mRNA表达则较单用LPS干预组显著降低（P 0.05）。Anti-Tim-3+Poly(I:C)组IFN-α、2’-5’OAS和MxA表达均显著高于单用Poly(I:C)组和Anti-Tim-3+LPS组（P 0.05），SOCS1mRNA表达则显著低于单用Poly(I:C)组（P 0.001）， TNF-α在Anti-Tim-3+Poly(I:C)组含量最低，但与其他干预组比较差异无统计学意义（P0.05）。CHC患者与健康对照相比，Anti-Tim-3+LPS组IFN-α和2’-5’OAS表达、Anti-Tim-3+Poly(I:C)组2’-5’OAS表达均显著低于健康对照（P 0.05），MxA和TNF-α在各组间比较差异无统计学意义，SOCS1除在Anti-Tim-3+Poly(I:C)组差异无统计学意义外，其余组均显著高于健康对照（P 0.05）。结论： 1慢性HCV感染患者血浆Gal-9水平显著升高，抗病毒治疗早期可提高IL-12表达水平，随着治疗时间的延长可逐渐降低Gal-9血浆水平，但治疗后随访24周时再次升高； 2体外Tim-3阻断联合TLR3激动剂干预可显著提高抗病毒相关因子表达水平，抑制负向免疫调节因子表达，为CHC免疫疗法提供了新的治疗靶点和科学依据。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.63

【参考文献】