问号钩端螺旋体锌离子依赖基质金属蛋白酶致病作用及机制

发布时间：2018-04-05 06:56

本文选题：问号钩端螺旋体　切入点：基质金属蛋白酶　出处：《浙江大学》2016年博士论文

【摘要】：背景：致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的钩体病是全球流行的自然疫源性人兽共患传染病,也是我国重点防疫和监控的主要传染病之一。致病性钩端螺旋体有7个基因种(genospecies),但问号钩体(Leptospira interrogans)是包括我国在内的大多数国家或地区优势流行的基因种,约70%我国钩体病患者为感染问号钩体黄疽出血群赖型所致。问号钩体感染动物后通常无症状或症状轻微,但可长期从尿液排出,污染自然水体形成传染源(疫水),人接触疫水感染后均发病。问号钩体具有强大的侵袭力,能迅速穿越黏膜或破损皮肤侵入宿主后进入血流,引起流感伤寒型钩体病,然后穿越小血管播散至肺、肝、肾及脑脊液等脏器或组织,分别引起肺出血及肺弥漫性出血型、黄疸出血型、肾型或脑膜脑炎型钩体病,重症钩体病患者病死率可高达30～50%。众所周知,侵袭性酶类是决定病原菌侵袭能力的毒力因子。问号钩体黄疸出血群赖型赖株(国内编号56601)基因组中LA0948、LA3400、LA3401基因产物被注释为锌依赖肽酶(Zn2+-dependent peptidase),但其功能及其致病作用迄今无研究报道。金属蛋白酶(metalloprotease,MP)也是一类锌依赖蛋白水解酶,胞外基质(extracellular matrix, ECM)分子是其主要水解底物。因此,确定问号钩体56601株LA0948、LA3400、LA3401基因产物是否具有MP功能及其在问号钩体感染过程中的作用,对于阐明问号钩体侵袭力物质基础及其作用机制具有重要意义。方法：采用生物信息学专用软件分析问号56601株LA0948、LA3400、LA3401基因结构及其功能结构域。构建问号钩体56601株LA0948、LA3400、LA3401基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯重组表达产物rLA0948、rLA3400、 rLA3401,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测其表达及提纯效果。纯化的rLA0948、rLA3400、rLA3401皮内注射免疫家兔获得抗血清,采用饱和硫酸胺沉淀联合DEAE-52离子交换层析法获得其IgG。采用偶氮底物紫外分光光度法,测定rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白活性及其Km和Kcat值、同时确定其水解底物时最适pH、温度、金属离子种类。采用SDS-PAGE法,检测rLA0948、rLA3400、rLA3401水解多种ECM分子的活性。另采用偶氮底物紫外分光光度法及多种蛋白酶抑制剂、金属离子螯合剂,进一步证实rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白的活性。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot法,分别检测问号钩体56601株感染HUVEC人脐静脉内皮细胞或HEK293人胚肾上皮细胞后LA0948、LA3400、LA3401基因mRNA水平及其产物外分泌情况。构建问号钩体56601株LA0948、LA3400、LA3401基因敲除突变株ΔLA0948、ΔLA3400、ALA3401。采用Transwell法,检测ΔLA0948、ΔLA3400、ΔLA3401突变株及其野生株穿越HUVEC或HEK293细胞单层的能力及其差异。采用问号钩体金地鼠感染模型,了解ΔLA0948、ΔLA3400、ΔLA3401突变株及其野生株感染动物后内脏播散、尿液排菌、引起组织病变的能力及其差异。结果：生物信息学分析结果显示,问号钩体56601株LA0948、LA3400、LA3401基因均有M16家族锌离子依赖基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease, MMP)酶功能结构域,但仅LA0948和LA3401基因有明确的MMP基序HXXEH (HFLEX和HLLEH)。所构建的LA0948、LA3400、LA3401基因原核表达系统均能有效表达目的重组蛋白rLA0948、rLA3400、rLA3401, Ni-NTA亲和层析法提取的rLA0948、rLA3400、rLA3401经SDS-PAGE后均显示为单一蛋白条带。rLA0948、rLA3400、rLA3401均能水解偶氮酪蛋白以及ECM分子胶原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型)、纤维连接蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)、核心蛋白多糖(decorin)。rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白Km和Kcat值分别为123.1785 μmol·L-1和5.987 s-1、742.7561μmol·L-1和24.113 s-1、340.1358μmol·L-1和17.676 s-1,水解时最适pH为7.4、最适温度为37℃。6种金属离子中,Zn2+、其次是Mg2+能增强rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白活性。各种蛋白酶抑制剂均可抑制rLA0948、rLA3400、rLA3401水解偶氮酪蛋白活性,但以苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制作用最强,其酶活性也可被金属离子螯合剂所抑制。因此,rLA0948、rLA3400、rLA3401均为金属蛋白酶,分别命名为L-MP1、L-MP2、 L-MP3。问号钩体56601株感染HUVEC或HEK293细胞后L-MP1-mRNA、 L-MP2-mRNA、L-MP3-mRNA水平显著升高(p0.05)并外分泌。ALA0948和ΔLA3401突变株穿越HUVEC或HEK293细胞单层的能力显著低于野生株(p0.05),ΔLA3400突变株穿越HUVEC或HEK293细胞单层的能力虽低于野生株,但无显著性差异(p0.05)。ΔLA0948、ΔLA3400、ΔLA3401突变株感染的金地鼠肺、肝、肾组织以及尿液中钩体数量明显少于野生株(p0.05),组织病变程度也明显低于野生株。结论：问号钩体黄疸出血群赖型56601株LA0948、LA3400、LA3401基因产物均为M16家族锌离子依赖基质金属蛋白酶(L-MMP1、L-MMP2、L-MMP3)。 L-MMP1、L-MMP2、L-MMP3在问号钩体56601株感染宿主时内脏播散、尿液排菌、组织病变发挥作用,故是问号钩体重要的毒力因子
[Abstract]:In this paper , we have found that the disease of leptospirosis is one of the major infectious diseases in the world , and it is one of the main infectious diseases in China . The activity of rLA0948 , rLA3400 and rLA3401 was determined by means of SDS - PAGE . The expression of rLA0948 , 螖LA3400 , 螖LA3401 and rLA3401 were determined by means of real - time fluorescence quantitative RT - PCR and Western blot . The activities of rLA0948 , rLA3400 and rLA3401 were significantly lower than those of wild strain ( P < 0.05 ) . L - MMP1 , L - MMP2 , L - MMP3 play a role in organ distribution , urinary excretion and tissue pathological changes in the infected host of the interrogans 56601 strain , so it is an important virulence factor of the question mark hook body .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R514.4

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