艾滋病毒潜伏感染细胞的体内分布及关键抑制因素研究

发布时间：2018-04-09 09:12

本文选题：人类免疫缺陷病毒　切入点：病毒储存库　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文

【摘要】：艾滋病,又称获得性免疫缺陷综合征(AIDS),是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的危害极大的感染性疾病。截止目前,全球仍有3900万HIV感染者,占全球人口的5.4‰,是现代历史上最严重的传染性疾病之一。高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是目前对抗HIV感染的主要武器,能有效降低HIV感染者的病毒载量,延缓艾滋病发生,延长感染者寿命。但HAART不能使感染者免疫功能完全恢复正常,也不能彻底清除机体内HIV病毒,停药后病毒载量迅速反弹。研究表明,病毒控制人群的反弹病毒来自宿主体内重新激活的病毒潜伏感染细胞。科研人员早已证实了HIV潜伏感染细胞的存在；而且现有高效HAART治疗也不能完全清除体内HIV潜伏感染细胞。因此,HIV潜伏感染细胞被认为是HIV感染治愈的主要障碍。为实现HIV感染的治愈,科研人员探索了多种HIV潜伏感染细胞的清除策略,如模拟“密西西比婴儿”的早期治疗策略,模拟“柏林病人”的骨髓移植策略,直接靶向病毒潜伏感染细胞的激活与清除策略以及增强机体抗病毒免疫的免疫抑制策略等,但上述策略的临床效果及适用性均不够理想；提示仍需要对病毒潜伏感染细胞及其影响因素进行深入的研究,特别是尚未突破的几个关键科学问题：一、艾滋病毒潜伏感染细胞的体内分布；二、抑制艾滋病毒反弹的关键因素。针对这两关键科学问题,本研究通过基于流式细胞术的病毒潜伏感染细胞检测策略的建立,检测艾滋病毒潜伏感染细胞的体内分布；同时,探寻艾滋病毒自然抑制模型中病毒有效控制的关键因素,深入研究艾滋病毒储存库分布和抑制的关键机制,为HIV感染的治疗策略研发提供研究思路与理论依据。第一部分艾滋病毒潜伏感染细胞的体内分布研究清除艾滋病毒潜伏感染细胞的首要任务是确定该细胞在体内分布情况。鉴于艾滋病毒潜伏感染细胞生物学上的特殊性,本研究首先建立了一种新型的艾滋病毒潜伏感染细胞的检测策略。通过比较SIV p27/gp41抗体细胞表面染色和SmartFlare技术在艾滋病毒复制阴性细胞分选中的优劣,比较CD3/CD28免疫磁珠、LPS与PHA在免疫细胞激活的差别,比较SIV p27抗体细胞内染色法和FlowRNA技术在病毒潜伏感染细胞分析中的优缺点；分别选择SmartFlare技术、CD3/CD28免疫磁珠/LPS和FlowRNA技术用于后续研究,同时优化实验条件,建立基于流式细胞术的艾滋病毒潜伏感染细胞检测策略(FlowVLIC).比较发现该检测策略检测的病毒潜伏感染细胞规模位于QVOA法和前病毒DNA-PCR法的检测结果之间,更符合艾滋病毒储存库的理论规模。之后,本研究使用该检测策略检了RT-SHIV恒河猴病毒抑制模型病毒潜伏感染细胞的组织、细胞分布,发现其病毒潜伏感染细胞主要分布于淋巴组织、肠道黏膜等部位,细胞类型以记忆性CD4+细胞为主。进一步,本研究还分析了不同部位、不同细胞来源潜伏病毒env、rt基因序列,发现潜伏病毒的整合位点与细胞类型存在一定的相关性,需进行更深入的机制研究。本研究首次初步确定了艾滋病毒潜伏感染细胞在非人灵长类动物模型体内的组织、细胞分布。第二部分艾滋病毒自然抑制的关键因素研究为达到HIV功能性治愈,即在不施以抗病毒治疗的前提下,机体也能有效的控制机体内的病毒复制,探寻病毒抑制的关键因素至关重要。本实验室前期使用SIV、SHIV病毒小剂量多次黏膜接种恒河猴,可高效诱导病毒自然抑制现象,类似于临床的精英控制者,但其原因未知。本研究首先通过猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)病毒小剂量多次直肠接种恒河猴建立病毒自然抑制模型,同时设立正常对照组,然后从细胞免疫、体液免疫和固有免疫等多个角度探寻病毒抑制的免疫机制。结果发现病毒抑制动物的细胞免疫和体液免疫未见明显升高,甚至低于正常对照组；但两组动物固有免疫反应存在明显的差异,病毒抑制组高于正常对照组,提示固有免疫反应在病毒自然抑制现象中发挥一定的作用。此外,本研究还探寻了病毒靶细胞和固有抗病毒因子在该现象中发挥的作用,结果发现两组动物不同组织的靶细胞数量和固有抗病毒因子表达和变异上没有明显差异。最后,本研究从感染病毒角度进行了探索,通过SGA方法获得了模型感染的奠基者(T/F)病毒,分析T/F病毒数量和适应性,发现病毒抑制动物的T/F病毒数量显著少于正常对照动物,而且感染病毒适应性也明显弱于正常对照动物。基于上述结果,提示机体的固有免疫反应和感染病毒特性在艾滋病毒自然抑制方面具有重要影响,后续在HIV感染治愈策略研究中需要考虑这些因素。综上所述,本研究通过建立基于流式细胞术的病毒潜伏感染细胞检测策略,确定了恒河猴模型体内的病毒潜伏感染细胞分布：建立的检测方法也可用于后续HIV感染治疗策略的有效性评价中；此外,本研究从细胞免疫、体液免疫、固有免疫、病毒靶细胞及病毒适应性等角度探寻艾滋病毒自然抑制模型体内病毒有效控制的关键因素。本研究深入探寻了病毒储存细胞体内分布、病毒反弹抑制的机制,为研发HIV感染的治疗策略提供研究思路与理论依据。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.91

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