野生型与缺失突变型HBx对肝细胞凋亡及microRNA表达谱的影响

发布时间：2018-04-27 00:24

  本文选题：肝细胞癌 + 乙型肝炎病毒　； 参考：《中南大学》2013年博士论文

【摘要】：研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,大量流行病学调查表明,长期慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是导致HCC的主要病因。近年来研究发现乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus X gene, HBx)在HBV相关HCC的发生发展中发挥重要的作用。HBx能通过多种方式影响肝细胞的凋亡,研究发现HBx对肝细胞凋亡的调节是HBV引起HCC的重要机制之一,然而HBx对肝细胞凋亡过程的调节作用仍存在争议,其确切机制尚不清楚。有研究显示HBx能促进细胞凋亡,但是也有研究显示HBx抑制细胞凋亡。有趣的是,一些研究发现在HBV相关的HCC组织中HBx基因常常发生缺失,尤其是羧基端的缺失。HBx羧基端的缺失可能改变了野生型HBx在控制细胞增殖、分化、凋亡方面的作用,从而在HBV相关HCC中发挥重要作用。我们前期的研究也显示,与野生型HBx相比,缺失突变型HBx能明显促进肝细胞的恶性转化,但其具体的分子机制尚有待阐明。 微小RNA(microRNA, miRNA)是一类在转录后水平调控基因表达的小分子RNA,参与发育、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程,在多种人类疾病包括肿瘤的发生中发挥着重要的作用。在肿瘤中miRNA表达的上调或下调可能起到癌基因或抑癌基因的作用。最近研究表明miRNA可能与HCC的发生与发展密切相关,但是miRNA在HBV相关HCC中的作用机制尚不十分清楚。 研究目的通过对野生型HBx (HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)真核表达载体转染肝细胞的生物学行为、细胞凋亡和microRNA表达谱的研究,探讨HBx与HBx-d382对肝细胞凋亡及microRNA表达的影响,以及这些变化在肝细胞恶性转化中的作用。 研究方法(1)复苏分别含pcDNA3.0、pcDNA3.0/HBx及pcDNA3.0/HBx-d382质粒的重组细菌DH-5α,提取质粒并用PCR、双酶切法鉴定质粒,对质粒进行DNA测序并应用DNASIS MAX2.9、clusterW生物软件进行分析。(2)应用脂质体转染的方法,将质粒pcDNA3.0、pcDNA3.0/HBx和pcDNA3.0/HBx-d382转染入L02肝细胞中,用G418筛选出稳定表达HBx和HBx-d382蛋白的肝细胞株。(3)用放线菌素D (Actinomycin D, ActD)、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a, TNF-a)处理L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx和L02/HBx-d382组肝细胞,诱导肝细胞凋亡。用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭(Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium iodium, Annexin V-FITC/PI)双染色流式细胞分析法检测并比较ActD、TNF-a处理0小时,12小时,24小时,48小时各组肝细胞凋亡情况；用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidy1transferase mediated dUTP nick end labelling, TUNEL)法检测并比较ActD、TNF-a处理24小时各组肝细胞凋亡情况；用RT-PCR (reverse transcription polymerase chainreaction)和Western-blot检测L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx和L02/HBx-d382组肝细胞中Survivin、PTEN (phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN) mRNA和蛋白的表达。(4)利用microRNA芯片,以L02/pcDNA3.0细胞为对照,研究分析HBx-d382和HBx转染L02肝细胞后肝细胞内miRNA表达谱的变化。 研究结果(1)证实了野生型HBx (HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)真核表达载体构建正确,并成功建立了稳定表达HBx和HBx-d382蛋白的肝细胞株。(2) Annexin V-FITC/PI流式细胞分析显示,ActD、TNF-a处理前,L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(3.38±0.53)%、(3.95±0.29)%、(3.23±0.69)%、(10.34±0.74)%：ActD、TNF-a处理12小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(4.07±0.27)%、(4.69±1.04)%、(4.09±0.16)%、(9.83±1.02)%;ActD、TNF-a处理24小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(19.30±3.00)%、(20.82±2.43)%、(18.18±2.48)%、(28.37±3.50)%;ActD、TNF-a处理48小时时L02、L02/pcDNA3.0.L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率分别为(35.25±5.17)%、(35.73±4.21)%、(31.13±4.50)%、(45.65±3.37)%。ActD、TNF-a处理前及处理后,L02/HBx组细胞早期凋亡率均高于L02、L02/pcDNA3.0和L02/HBx-d382组(p0.05),而后3组细胞之间早期凋亡率差异无统计学意义(p0.05)；与ActD、TNF-a处理前相比,ActD、TNF-a处理12小时时L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率与处理前比较差异无统计学意义(p0.05); ActD、TNF-a处理24小时和48小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞早期凋亡率均增加(p0.05),且处理48小时时各组肝细胞早期凋亡率均高于处理24小时时(p0.05)。TUNEL法检测显示ActD、TNF-a处理24小时时L02、L02/pcDNA3.0、L02/HBx-d382和L02/HBx组细胞凋亡指数分别为(21.97±4.91)%、(23.49±3.26)%、(22.55±4.86)%、(33.68±4.43)%。L02/HBx组细胞细胞凋亡指数高于L02、L02/pcDNA3.0和L02/HBx-d382组(p0.05),而后3组之间比较差异无统计学意义(p0.05)。Survivin mRNA和蛋白在L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx-d382和L02/HBx细胞中的相对表达强度分别为0.66±0.09和0.69±0.12、0.66±0.07和0.76±0.09、0.63±0.13和0.77±0.14、0.26±0.09和0.13士0.12。PTEN mRNA和蛋白在L02、L02/pcDNA3.0、 L02/HBx-d382和L02/HBx细胞中的相对表达强度分别为0.21±0.09和0.19±0.13、0.24±0.12和0.21±0.07、0.22±0.11和0.23±0.06、0.52±0.09和0.71±0.04。与L02、L02/pcDNA3.0和L02/HBx-d382细胞相比,L02/HBx细胞中Survivin mRNA及蛋白表达下调(p0.01), PTEN mRNA及蛋白表达上调(p0.01); Survivin、PTEN mRNA和蛋白在L02、L02/pcDNA3.0细胞和L02/HBx-d382细胞中的表达差异无统计学意义(p0.05)。(3) microRNA芯片结果显示,与L02/pcDNA3.0相比较,L02/HBx肝细胞内hsa-miR-7、hsa-miR-1274a、hsa-miR-137、hsa-miR-6634种miRNA表达上调,hsa-miR-338、 hsa-miR-24、hsa-miR-29、hsa-miR-744、hsa-miR-455、 hsa-miR-324、hsa-miR-551b、hsa-miR-340、hsa-miR-590hsa-miR-660、hsa-miR-11311种miRNA表达下调；而L02/HBx-d382肝细胞内hsa-miR-501、hsa-miR-595、hsa-miR-1307、 hsa-miR-1180、hsa-miR-497、hsa-miR-1246、hsamiR-6237种miRNA表达上调,hsa-miR-338、hsa-miR-551b、hsa-miR-1、hsa-miR-455、 hsa-miR-200c5种miRNA表达下调。除均能引起hsa-miR-338、 hsa-miR-455、hsa-miR-551b表达下调外,HBx与HBx-d382引起肝细胞内表达上调或下调的miRNA的种类不同。 结论(1)证实了野生型HBx (HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)真核表达载体构建正确,并成功建立了稳定表达HBx和HBx-d382蛋白的肝细胞模型,为深入研究HBx和HBx-d382基因及其蛋白在HBV相关HCC中的作用奠定了基础。(2)野生型HBx(HBx)和缺失突变型HBx (HBx-d382)对肝细胞凋亡的影响是不同的。野生型HBx (HBx)可能通过下调Survivin表达并上调PTEN的表达发挥促细胞凋亡的作用,而缺失突变型HBx(HBx-d382)可能具有取消野生型HBx促细胞凋亡的能力。HBx基因可能通过缺失型突变修饰其生物学功能,在HCC发生中起着重要的作用。(3)HBx和HBx-d382基因转染肝细胞后均能引起肝细胞内miRNA表达谱发生变化,但两者对肝细胞miRNA表达谱有不同的影响,HBx和HBx-d382可能通过影响不同miRNA的表达而影响肝细胞的凋亡。
[Abstract]:Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors in the world. A large number of epidemiological investigations show that chronic hepatitis B virus (hepatitis B virus, HBV) infection is the main cause of HCC. In recent years, the X gene of hepatitis B virus (hepatitis B virus) has been found. ) it plays an important role in the development of HBV related HCC..HBx can affect the apoptosis of liver cells in a variety of ways. It is found that the regulation of HBx to hepatocyte apoptosis is one of the important mechanisms of HBV to cause HCC. However, the regulatory role of HBx on the process of hepatocyte apoptosis is still controversial, and its exact mechanism is not clear. Some studies show HBx energy Promoting apoptosis, but there are also studies showing that HBx inhibits apoptosis. Interestingly, some studies have found that the HBx gene is often missing in HBV related HCC tissues, especially the deletion of the carboxyl terminus of the carboxyl terminus may alter the role of wild type HBx in controlling cell proliferation, differentiation, and apoptosis, thus in HBV related HCC. Our previous study also showed that the missing mutant HBx could significantly promote the malignant transformation of hepatocytes compared with wild type HBx, but the specific molecular mechanisms still remain to be elucidated.
Small RNA (microRNA, miRNA) is a small molecule RNA that regulates gene expression at post transcriptional level. It participates in many biological processes, such as development, cell proliferation, differentiation, apoptosis and other biological processes. It plays an important role in the occurrence of a variety of human diseases including tumors. The up-regulation or down regulation of miRNA expression may be the oncogene or tumor suppressor gene in the tumor. Recent studies have shown that miRNA may be closely related to the occurrence and development of HCC, but the mechanism of miRNA in HBV related HCC is not yet clear.
Objective to investigate the effects of HBx and HBx-d382 on hepatocyte apoptosis and the expression of microRNA by transfection of wild type HBx (HBx) and deletion mutant HBx (HBx-d382) eukaryotic expression vector to hepatocytes, and to explore the effect of HBx and HBx-d382 on hepatocyte apoptosis and microRNA expression, and the role of these changes in the malignant transformation of liver cells.
Research methods (1) resuscitation of recombinant bacterial DH-5 alpha containing pcDNA3.0, pcDNA3.0/HBx and pcDNA3.0/HBx-d382 plasmids respectively, extract plasmids and identify plasmids with PCR, double enzyme digestion, DNA sequencing of the plasmid and analysis of DNASIS MAX2.9, clusterW biological software. (2) liposome transfection method, plasmid pcDNA3.0, pcDNA3.0/HBx and pcDNA3 .0/HBx-d382 transfected into L02 hepatocytes, using G418 to screen liver cell lines that stably express HBx and HBx-d382 protein. (3) use actinomycin D (Actinomycin D, ActD) and tumor necrosis factor A (tumor necrosis) to induce hepatocytes to induce apoptosis of liver cells. Fluorescein cyanate / Annexin V-fluorescein isothiocyanate/Propidium iodium (Annexin V-FITC/PI) double staining flow cytometry was used to detect and compare with ActD, TNF-a for 0 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours of hepatocyte apoptosis, and terminal deoxy nucleotidyl transferase mediated in situ nick end labeling. (terminal deoxynucleotidy1transferase mediated dUTP nick end labelling, TUNEL) method to detect and compare ActD, TNF-a treatment for 24 hours of liver cell apoptosis. The expression of hosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN) mRNA and protein. (4) the changes in the expression profiles in hepatocytes after hepatocyte transfection were analyzed by microRNA chips.
The results (1) confirmed that the eukaryotic expression vector of wild type HBx (HBx) and deletion mutant HBx (HBx-d382) was constructed correctly, and the liver cell lines expressing HBx and HBx-d382 protein were successfully established. (2) Annexin V-FITC/PI flow cytometry showed that before ActD, TNF-a treatment, L02, L02/pcDNA3.0, and apoptotic cells were apoptotic. The rates of (3.38 + 0.53)%, (3.95 + 0.29)%, (3.23 + 0.69)%, (10.34 + 0.74)%:ActD, and TNF-a treatment for 12 hours at L02, L02/pcDNA3.0, L02/HBx-d382 and L02/HBx were respectively (4.07 + 0.27)%, (4.69 + 1.04)%, (4.69 + 3.23%)%, ActD, TNF-a processing L02, L02/pcDNA3.0, L02/HBx-d382, and L02/HBx groups. The early apoptosis rate was (19.30 + 3)%, (20.82 + 2.43)%, (18.18 + 2.48)%, (28.37 + 3.50)%, ActD, TNF-a treatment for 48 hours, L02, L02/pcDNA3.0.L02/HBx-d382 and L02/HBx group, respectively (35.25 + 5.17)%, (35.73 + 4.21)%, (35.73 + 18.18)%,%.ActD. Before and after TNF-a treatment, L02/HBx group cells were early The rate of apoptosis was higher than that of L02, L02/pcDNA3.0 and L02/HBx-d382 (P0.05), and there was no significant difference in the early apoptosis rate between the 3 groups (P0.05). Compared with ActD, TNF-a before TNF-a treatment, the apoptosis rates of L02, L02/pcDNA3.0, L02/HBx-d382, and before treatment were not statistically significant. .05); ActD, TNF-a treatment at 24 hours and 48 hours increased the apoptosis rate of cells in L02, L02/pcDNA3.0, L02/HBx-d382 and L02/HBx groups (P0.05), and the early apoptosis rate of the hepatocytes at 48 hours was higher than that of the treatment for 24 hours (P0.05).TUNEL assay display ActD, TNF-a treatment 24 hours. The apoptotic index was (21.97 + 4.91)%, (23.49 + 3.26)%, (22.55 + 4.86)% and (33.68 + 4.43)%.L02/HBx group cell apoptosis index higher than that of L02, L02/pcDNA3.0 and L02/HBx-d382 group (P0.05), and the difference between the 3 groups was not statistically significant (P0.05).Survivin mRNA and protein in L02, L02/pcDNA3.0, L02/HBx-d382 and L02/HBx cells. Relative expression intensity was 0.66 + 0.09 and 0.69 + 0.12,0.66 + 0.07 and 0.76 + 0.09,0.63 + 0.13 and 0.77 + 0.14,0.26 + 0.09 and 0.13 0.12.PTEN mRNA and protein in L02, L02/pcDNA3.0, L02/HBx-d382 and L02/HBx cells were 0.21 + 0.09 and 0.19 + 0.13,0.24 + 0.12 and 0.21 + 0.07,0.22 + 0.52 + 0.09 and 0.71 + 0.04. were compared with L02, L02/pcDNA3.0 and L02/HBx-d382 cells, Survivin mRNA and protein expression down regulated (P0.01), PTEN mRNA and protein expression up up (P0.01). Compared with L02/pcDNA3.0, the expression of hsa-miR-7, hsa-miR-1274a, hsa-miR-137 and hsa-miR-6634 in the liver cells of L02/HBx was up regulated, and hsa-miR-338, hsa-miR-24, hsa-miR-29, hsa-miR-744, hsa-miR-455. The expression of hsa-miR-501, hsa-miR-595, hsa-miR-1307, hsa-miR-1180, hsa-miR-497, hsa-miR-1246, hsamiR-6237 is up regulated in d382 liver cells, hsa-miR-338, hsa-miR-551b, hsa-miR-1, and down regulation. The expression of miRNA in cells was different.
Conclusion (1) the correctness of the eukaryotic expression vector of wild type HBx (HBx) and deletion mutant HBx (HBx-d382) was confirmed, and a hepatocyte model was successfully established for the stable expression of HBx and HBx-d382 protein, which laid the foundation for the in-depth study of HBx and HBx-d382 genes and their proteins in HBV related HCC. (2) wild type HBx (HBx) and deletion mutation types. The effect of (HBx-d382) on hepatocyte apoptosis is different. Wild type HBx (HBx) may play a role in promoting apoptosis by downregulating the expression of Survivin and up regulating the expression of PTEN, and the deletion mutant HBx (HBx-d382) may have the ability to cancel the apoptosis of the wild type HBx, and the.HBx gene may modify its biological work through the deletion mutation. Yes, it plays an important role in the occurrence of HCC. (3) the transfection of HBx and HBx-d382 genes to hepatocytes can cause changes in the miRNA expression profiles in hepatocytes, but both of them have different effects on the miRNA expression profiles of hepatocytes. HBx and HBx-d382 may affect the apoptosis of liver cells by affecting the expression of different miRNA.

【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62;R735.7

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本文编号：1808363