异尖线虫病免疫诊断方法的建立及Ⅲ期幼虫cDNA文库构建

发布时间：2018-06-16 09:32

  本文选题：异尖线虫 + Ⅲ期幼虫　； 参考：《中国疾病预防控制中心》2013年硕士论文

【摘要】：异尖线虫病是一种因食用生的或未煮熟的含异尖线虫Ⅲ期幼虫的海鱼而引起的消化系统食源性寄生虫病。主要致病的虫种为简单异尖线虫(Anisakis simplex)和派氏异尖线虫(Anisakis pegreffii)。该病呈世界性分布,主要引起胃异尖线虫病、肠异尖线虫病和胃肠外异尖线虫病。我国对黄海、渤海、北海等海域及沿海城市的海鱼调查中均发现了异尖线虫。目前确诊异尖线虫病仍以纤维内窥镜检查发现虫体为依据,而对临床上恶心、呕吐、上腹部疼痛等不典型的异尖线虫病症状的确诊存在困难。虽然免疫学、分子生物学技术已应用于异尖线虫病的辅助诊断及鉴定,但仍缺乏有效的诊断试剂和快速诊断方法。因此,本研究欲以异尖线虫Ⅲ期幼虫为材料,通过提取异尖线虫Ⅲ期幼虫粗抗原建立ELISA法和Western Blot,以及制作异尖线虫Ⅲ期幼虫免疫层析试纸条,并构建异尖线虫Ⅲ期幼虫cDNA文库,以期获得高效、快速的免疫诊断方法及获得有价值的诊断抗原。 本研究以东海海域带鱼为研究材料,人工剖检带鱼,在带鱼体腔、肠系膜、肝脏等处寻找异尖线虫Ⅲ期幼虫,并进行形态学观察及分子鉴定。在此之后对异尖线虫Ⅲ期幼虫,以匀浆冻融及超声法制备Ⅲ期幼虫可溶性抗原(soluble antigens of third-stage larvae of anisakis, SAA),进行ELISA和Western Blot用于检测与其他寄生虫病人血清是否存在交叉反应。同时建立一种检测异尖线虫病的免疫层析试纸条,并对其进行测试。最后构建异尖线虫Ⅲ期幼虫cDNA文库,并对此文库进行评价。 结果,共解剖购自东海海域的带鱼132条,收集异尖线虫幼虫1695条,平均每条带鱼体内都有10条以上的异尖线虫Ⅲ期幼虫,感染率为100%。虫体平均长度20-30mmm,头部有特征性的乳突、钻齿尾部有小棘,身体呈波浪形蠕动。经BLAST比对,与已提交到Genbank的派氏异尖线虫(JQ900763.1)的序列相似性达99%。 以制备的异尖线虫Ⅲ期幼虫可溶性抗原(SAA)进行ELISA试验,检测异尖线虫感染鼠血清,敏感性100%,特异性100%。与肝吸虫病人和囊虫病人血清各有10%的交叉反应,与血吸虫病、旋毛虫病、蛔虫病、钩虫病、弓形虫病、舌形虫病等病人血清未见交叉反应。以SDS-PAGE技术对SAA抗原作进一步分析,获得两条分子量为38、55kDa的主蛋白带和分子量界于10～70kDa之间的10条次带。经Western blot分析,能被感染大鼠血清识别的条带中,Mr170、130、73、38、22、15kDa等条带反应较强。与血吸虫病、肝吸虫病、囊虫病、旋毛虫病、蛔虫病、钩虫病、弓形虫病、舌形虫病病人及正常人血清无交叉反应条带,而与肺吸虫、鞭虫病人血清分别在Mr70kDa和Mr93kDa处有交叉反应条带出现。 以制备的异尖线虫Ⅲ期幼虫可溶性抗原(SAA)点膜,制备胶体金免疫层析试纸条。检测异尖线虫免疫兔血清3份,感染大鼠血清10份,均显示阳性,敏感性为100%,特异性为100%。共检测其他寄生虫病人血清161份,其中18份肝吸虫病人血清中有1份显示为阳性,同肝吸虫病人血清的交叉反应率5.6%(1/18),与其它寄生虫病人血清未见交叉反应。 采用SMART技术,即利用毫微克的RNA或mRNA获得高质量和全长的cDNA文库,可以保存全部mRNA5'末端的序列,且λ TriplEx2载体具有高低定量,重组蓝白斑检测,调节克隆插入片段的表达等优点。成功构建异尖线虫Ⅲ期幼虫的cDNA文库。噬菌体文库滴度为2.92×106pfu/ml。经蓝白斑筛选,重组率为95.7%。随机挑选29个噬菌斑进行PCR,看平均片段长度。结果显示插入率为97.9%,最大片段长度为2000bp,最小片段长度为400bp,平均片段长度为850bp。 综上所述,本研究以异尖线虫Ⅲ期幼虫为研究对象,对其进行分子鉴定后,确认为简单异尖线虫姐妹种---派氏异尖线虫。建立的ELISA方法、Western Blot方法对于异尖线虫病有较好的免疫诊断效果。成功制作了一种检测异尖线虫病的胶体金免疫层析试纸条,此试纸条敏感性高,特异性好,交叉反应少,且制作简便,可做为异尖线虫病的快速检测试纸条。最后成功构建了异尖线虫Ⅲ期幼虫的全长cDNA文库,为后续进行基因功能研究,筛选免疫诊断重组抗原奠定了坚实的基础。
[Abstract]:Aisakis simplex ( Anisakis simplex ) and Anisakis similis ( Anisakis simplex ) . In order to obtain high efficiency , rapid immunological diagnosis and to obtain valuable diagnostic antigens , this study has been applied to the diagnosis and identification of isotip nematode 鈪，

本文编号：2026208