肠道新发原虫病病原体感染及基因型特征研究和多重PCR方法的建立

发布时间：2018-07-17 20:41

【摘要】：肠道新发原虫病是全球面临的重要公共卫生问题,也是人类迄今为止面临的最困难的问题之一,可暴发流行,造成严重的突发公共卫生事件。其中,隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫和环孢子虫感染分别引起以腹痛、急性或自限性腹泻和营养不良为主要症状的隐孢子虫病、贾第虫病、微孢子虫病和环孢子虫病,是近年来被高度关注的人兽共患肠道原虫,也是重要的机会致病原虫,在婴幼儿和免疫功能受损或缺陷者易感并可引起严重的腹泻,乃至死亡。隐孢子虫病被WHO列为世界六大腹泻病之一；隐孢子虫病和环孢子虫病列入美国FoodNet食源性监测疾病；隐孢子虫和贾第虫是我国生活饮用水必检指标。这些原虫可感染人和多种动物,主要经粪-口途径直接接触或食入卵囊或包囊污染的食物或水而传播,腹泻患者、免疫功能受损或缺陷者隐孢子虫等原虫的感染率较高。本研究以腹泻患者、HIV/AIDS患者以及可能与人关系密切的宠物和观赏动物为研究对象,进行新发肠道原虫病病原检测和分子鉴定,并对获得的安氏隐孢子虫和毕氏微孢子虫进行种群遗传结构研究,对于研究新虫种、新基因型、疾病传播、病原溯源及临床诊断和治疗都有着重要的意义。此外,鉴于上述四种原虫的重要性,本研究还首次建立了能同时检测四种肠道原虫的多重PCR方法。主要研究结果如下：1.临床腹泻患者隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫感染及基因型特征分析：上海市浦东新区某医院252例临床腹泻患者中,肠道原虫检测总阳性率为30.16%(76/252),隐孢子虫和微孢子虫的阳性率均为13.49%(34/252),贾第虫阳性率为6.75%(17/252),未发现环孢子虫感染。其中有8例患者同时感染隐孢子虫和微孢子虫,1例患者同时感染隐孢子虫和贾第虫。进一步基因分型发现,所有隐孢子虫阳性样本均为安氏隐孢子虫,所有微孢子虫均为毕氏微孢子虫；贾第虫阳性样本中,除1份为集聚体B外,其余16份均为集聚体C。同时发现,冬季样本隐孢子虫和微孢子虫检测阳性率较春季高,而这三种原虫感染患者在年龄和性别上未发现统计学差异。该研究首次发现安氏隐孢子虫在人群的流行,及贾第虫聚集体C可感染人。本研究首次提出安氏隐孢子虫是继人隐孢子虫、微小隐孢子虫和火鸡隐孢子之外的第四种感染人的优势虫种；贾第虫集聚体C是继聚集体A和B之外的又一种人兽共患新的基因型；揭示了安氏隐孢子虫和贾第虫聚集体C的公共卫生危害。2. HIV/ADDS患者隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫感染及基因型特征分析：对285份广西地区的HIV/AIDS患者粪便检测发现存在多种肠道原虫感染。鉴定出两例隐孢子虫,核苷酸测序分析表明1例为安氏隐孢子虫,1例为人隐孢子虫,gp60亚型分析为I bA19G2亚型。贾第虫的阳性率为2.81%(8/285),其中,7份贾第虫阳性样本为集聚体B,1份为集聚体C。微孢子虫阳性率为11.58%(33/285),经鉴定发现3个新基因型,分别命名为GX25(1例)、GX456(1例)和GX458(1例),其余阳性样本属于4个基因型：PigEBITS7(7例)、TypeⅣ/K(8例)、D(11例)、EbpC(4例),进化树分析表明所有的微孢子虫样本同处于进化树中的Groupl。进一步分析发现来自农村患者感染微孢子虫阳性率明显高于其他职业者,饮用生水为主者微孢子虫阳性率明显高于其他类型饮水者,揭示该地区微孢子虫的感染与患者的卫生及饮水状况等有密切关系。3.宠物及观赏动物贾第虫的感染及基因型特征分析：对来自上海市某宠物医院和某动物园的共84份动物粪便样本进行贾第虫的检测。结果显示,PCR检测阳性率为15.48%(13/84),形态学检查阳性率为5.85%(5/84)。PCR检测中,谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的扩增率最高,为92.31%(12/13),其次为β-贾第素(BG)基因和磷酸丙糖异构酶(TPI)基因则分别为69.23%(9/13)和53.85%(7/13)。序列分析发现4条新的基因序列,集聚体分析显示所检测样本中存在4个集聚体：C、D、E和F,同时发现有3份样本存在集聚体D和C间转换,1份样本集聚体F和D间转换。结果表明PCR方法具有较高的敏感性,且不同标志基因的扩增效率不同,多位点基因分型(MLG)方法比扩增单个基因可降低漏检率。由于两条序列在氨基酸水平上与人源贾第虫基因序列同源性为100%,表明这些贾第虫在一定程度上存在人兽共患的潜能。4.安氏隐孢子虫和毕氏微孢子虫多位点序列分型(MLST):针对上述安氏隐孢子虫和毕氏微孢子虫样本采用MLST分析,研究其种群遗传结构,结果显示安氏隐孢子虫样本MS1和MS3位点的基因型均为A4亚型(牛源),表明该人源安氏隐孢子虫传染源可能为牛。本研究还对5个位点均扩增成功的18个微孢子虫样本样本进行分析,尚未发现明确的亚群结构区分。5.隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫多重PCR检测方法的建立：鉴于四种肠道新发原虫的重要性,本研究首次建立了一种可同时检测隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫和环孢子虫等四种肠道原虫的多重PCR方法,国内外尚未见报道。能特异检测特定病原,最低检测拷贝数可达10个/μL,与单病原(单个基因)扩增方法比较,符合率可达90%。本研究成功建立了多重PCR检测四种原虫的方法,特异性和敏感性较高,稳定性较好,能用于临床和疾控现场样本多病原的同时检测。
[Abstract]:It is one of the most difficult problems faced by the world . It is also one of the most difficult problems faced by mankind to date , which causes serious public health events .
Food Net Food - borne Surveillance Diseases in the United States ;
The results were as follows : 1 . The positive rate of intestinal protozoan was 30.16 % ( 76 / 252 ) .
The results showed that there were no statistical differences in both age and sex . The results showed that the positive rate of cryptosporosis and microsporozoites in winter samples were higher than that in spring , while those of these three protozoan infected patients had no statistical difference in age and sex .
The Giardia aggregate C is a new type of human animal with the addition of aggregates A and B .
The public health hazards of the conidiospore insect and the Giardia aggregate C are revealed . The results showed that the positive rate was 15.48 % ( 13 / 84 ) , and the positive rate was 92.31 % ( 12 / 13 ) . The multiplex PCR method of four kinds of intestinal protozoans , such as Giardia , Microsporozoites and Cyclospora , has not been reported at home and abroad . It is possible to detect the specific pathogen at home and abroad . The detection copy number can be up to 10 / 渭L , and the coincidence rate can be up to 90 % . This study successfully establishes the methods of multiplex PCR to detect four kinds of protozoan . It has high specificity and sensitivity and good stability . It can be used for simultaneous detection of multiple pathogens in clinical and disease control field samples .
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;R531

【相似文献】