免疫磁珠捕获技术结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫耶尔森氏菌的研究

发布时间：2018-09-05 11:44

【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)引起的一种烈性传染病,其具有传染性强、病死率高、传播速度快、自然疫源性等诸多特点。人类历史上,曾经发生过三次鼠疫大流行,引起数以亿计人死亡,给人类带来过沉重灾难。在我国,鼠疫被列为甲类传染病。随着现代医学技术的不断发展,鼠疫疫情虽已得到有效控制,但近年来,动物间鼠疫的流行区域不断扩大,人间鼠疫病例呈上升态势。与此同时,鼠疫菌作为一种典型的生物战剂及生物恐怖制剂,时刻威胁着人类的安全。由此可见,鼠疫的监控对人类健康安全、经济发展和社会稳定具有重要意义。众所周知,对鼠疫菌快速、有效的检测是控制其传染的重要手段。目前,对鼠疫菌的常规检测主要包括细菌学检测、免疫学检测、分子生物学检测等。细菌学检测一般分四步进行——显微镜镜检、细菌培养、鼠疫噬菌体裂解实验、动物实验。该方法耗时长、需要大量人力物力,不适用于鼠疫菌大量筛查及现场检测。分子生物学检测,即通过体外扩增特异性的核酸片段实现对鼠疫菌的检测,该方法虽然具有快速、灵敏、特异等优点,但其往往需要特定仪器才能进行,且价格昂贵,操作不便。因此,不适用于偏远地区实验室及野外检测。免疫学方法是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法,主要以胶体金、酶联免疫吸附实验等方法为代表。这些方法具有操作简便、安全性高、特异性好且灵敏度高等优点,但在检测前一般都需要进行增菌培养,耗费大量时间,并且该方法抗干扰能力较差。因此,建立一种可快速、高效、适用于偏远地区,且抗干扰能力强的检测方法十分重要。环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)是由Notomi等人于2000年报道的一种分子生物学检测新技术。此技术针对靶基因的4—6个特异性区域,分别设计特异性引物,在一种具备链置换活性的dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下,在恒温条件即可实现对目的基因快速、高效、特异性检测。lamp扩增反应过程中会形成大量的、白色焦磷酸镁(mg2p2o7)沉淀,因此,可通过肉眼或运用实时浊度仪检测沉淀生成量的多少来判断扩增反应进行的程度。若在反应前向反应体系中加入钙黄绿素这种复合荧光素,则可通过肉眼直接观察反应体系颜色是否由黄色变为绿色来判断反应是否发生。实际检测中,待检样本通常是复杂的混合物,多种杂质往往会对检测结果产生干扰,难于直接进行检测。免疫磁珠技术(immunomagneticbeadstechniquces)能将靶标物与杂质分离,从而实现靶标物的富集。免疫磁珠技术是20世纪70年代兴起的一种基于免疫学原理的分离技术。此技术是一种利用具有超顺磁性的磁性微球作为载体对目标物进行捕获、富集的生物学技术。这种具有超顺磁性的微球在经过一系列活化后,并与生物基团或者生物配体有效地结合在一起才可形成免疫磁珠,实现对待检物的特异性分离。本研究将免疫磁珠分离技术(immunomagneticseparation,ims)与环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofdna,lamp)相结合,以lamp特异性检测为基础,以磁珠捕获dna或免疫磁珠捕获菌体为条件,分别建立了磁珠捕获dna法结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫菌以及免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术快速检测鼠疫菌。分别对两种检测方法的lamp检测体系、磁珠捕获体系、免疫磁珠制备体系进行优化,以及分别对每种方法的灵敏度、特异性、抗干扰能力、实际样本应用等多个方面均进行了全面的评价。本研究基于鼠疫菌3a保守序列,设计lamp引物,并以扩增效率、特异性为标准从设计出的多组引物中筛选出最佳引物。并以筛选出的最佳引物为基础,对lamp反应体系中,bstdna聚合酶加入量、dntps加入量、镁离子浓度等反应条件进行了优化,最终建立了25μl体积的lamp反应体系,具体为:10×thermopolbuffer2.5μl,mgso4(100mm)1.5μl,dntpmix(2.5mm)14μl,fip(100mm)0.4μl,bip(100mm)0.4μl,f3(10mm)0.5μl,b3(10mm)0.5μl,lf(10mm)0.2μl,bstdnapolymerase,largefragment(8,000u/ml)1μl,水3μl,模板1μl。65℃反应60min。并对建立的lamp反应体系在鼠疫菌检测方面的灵敏度、特异性及抗干扰能力等性能进行评价。实验结果显示,建立的lamp反应体系在鼠疫菌检测方面有良好的特异性、抗干扰能力,灵敏度可达100copy/ml。在磁珠捕获dna法结合lamp技术快速检测鼠疫菌研究中,将lamp技术与磁珠捕获dna技术相结合,依据磁珠加入量、dna富集程度对磁珠捕获dna体系进行优化,得到最佳体系。并对该检测方法的灵敏度、特异性及抗干扰能力进行了评价,将该方法与常规pcr检测技术进行对比。实验结果显示,该方法特异性良好,对鼠疫菌检测灵敏度可达10copy/ml,较常规pcr技术灵敏度高100倍。在脾脏、肺脏干扰情况下其灵敏性依然可以达到10copy/ml,比常规pcr技术高出1000倍。在肝脏悬液干扰情况下该检测方法的灵敏度稍有降低至103copy/ml,仍然比常规pcr技术高出10倍。在免疫磁珠捕获菌体法结合lamp技术快速检测鼠疫菌研究中,首先,基于实验室已有的鼠疫菌f1单克隆抗体,采用edc/nhss化学偶联法将鼠疫菌抗体与磁珠相偶联制备免疫磁珠。按实际捕获效率、抗体偶联率、抗体添加量、检测中免疫磁珠用量等进行了优化,并对该检测方法的灵敏度、特异性、抗干扰能力等方面进行了全面评价,并将该方法与常规pcr检测技术进行对比。实验结果显示,该方法可特异地捕获待检混合物中的鼠疫菌,灵敏度为1copy/ml,较常规pcr技术灵敏度高100倍。在脾脏、肺脏干扰情况下其灵敏性为10copy/ml,其灵敏度比常规pcr技术高出1000倍。在肝脏干扰情况下灵敏性为100copy/ml,较常规pcr技术高100倍。随后,采用灭活鼠疫菌为免疫原免疫小鼠,经小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、细胞株克隆、腹水制备、抗体纯化等步骤制备出不同于f1抗体的鼠疫菌单克隆抗体,并将制备出的单抗应用于免疫磁珠捕获菌体法结合环介导恒温扩增技术检测鼠疫菌。实验结果显示,制备出的抗体效价较高,且在检测方法上有较好的灵敏度,可应用于鼠疫菌的快速检测。本研究建立了两种较为成熟的鼠疫菌检测方法,这两种检测方法操作简便、无需大型仪器、成本低廉,且具有较高的灵敏性、极强的特异性、很强的抗干扰能力,所以,这两种检测技术适合用于现场筛查、野外作业及偏远地区检测工作的应用。在现有免疫学检测方法中,表达于鼠疫菌表面的F1抗原已成为唯一的靶标物,而鼠疫菌只有以37℃人工培养或哺乳动物体内为条件才可在表面形成F1抗原,而鼠疫菌最适生长温度为26℃,且自然环境中温度远远低于37℃,因此,自然环境下,鼠疫菌表面并不表达F1抗原。这一现象的存在,对现有鼠疫菌免疫学方法的检测带来诸多不便。本研究制备出的单克隆抗体对表面不表达F1抗原的鼠疫菌有良好的特异性,弥补了现阶段免疫学检测的漏洞,为鼠疫菌的检测提供了更广阔的前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.6;R516.8

【相似文献】