【摘要】：研究背景： 结核病（Tuberculosis，TB）一直是一个备受关注的全球性健康问题，迄今为止，关于结核病的发病机制，特别是机体对结核感染的免疫机制并未完全阐明。近年来，具有天然免疫样作用的γδ T细胞在结核感染中的免疫作用，已经得到众多研究者的实验研究和临床观察的证实。IL-17是一种重要的促炎性细胞因子，近年来研究感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）以及卡介苗感染的小鼠模型发现，分泌IL-17的细胞主要来源于γδ T细胞。本实验室前期研究发现，在正常人外周血中存在产生IL-17的γδ T细胞,而且这些细胞在结核病患者外周血中是增高的，提示产生IL-17的γδ T细胞可能涉及TB的发病过程。虽然有研究指出，人γδ T细胞在磷酸化抗原刺激下加入诱导性的细胞因子诱导培养，也可以诱导分泌IL-17，但Mtb多肽类抗原如Mtb耐热抗原（Mtb-HAg）和多克隆抗体如抗TCR-γδ抗体刺激人γδ T细胞后对极化细胞因子诱导分化γδ T细胞产生IL-17有何作用和影响尚不清楚。另外，诱导人γδ T细胞分化的培养条件的研究，，以及产生IL-17的健康人γδ T细胞属于何种亚群，也有待进一步探讨。 目的： 探讨Mtb耐热抗原（Mtb-HAg）和抗TCR-γδ抗体在刺激人γδ T细胞诱导分化产生IL-17中的作用。检测和分析健康人γδ T细胞的不同亚群经诱导极化后产生IL-17有何不同，以探讨健康人γδ T细胞不同亚群产生IL-17的作用。 方法： 1.采集健康人外周血单个核细胞（PBMC）经过免疫磁珠分选得到纯化的γδ T细胞后，加入Mtb-HAg或包被的抗TCR-γδ纯化抗体，再加或不加CD28单抗进行刺激，同时加或不加IL-17极化细胞因子组合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）诱导培养10-12d。然后收集诱导极化培养的γδ T细胞，经PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法检测产生IL-17的细胞数。 2.采集健康人外周血浓缩白细胞（buffy coat cell）分离PBMC后冷冻保存。取冻存的PBMC复苏后经MACS得到纯化的γδ T细胞，用含10%NBS或人AB血清的IMDM培养液或RPMI-1640培养液进行培养，每孔均加入抗TCR-γδ抗体，CD28单抗以及IL-17极化细胞因子组合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）诱导培养。培养10-12d时，收集诱导极化培养的γδ T细胞，经PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法检测不同培养液培养下产生IL-17的细胞数。 3.复苏经冻存的健康人的PBMC，免疫磁珠分选法分选γδ T细胞，得到Vδ2+γδ T细胞和Vδ2 γδ T细胞两个亚群，用含10%人AB血清的IMDM培养液细胞浓度后加入抗TCRγδ抗体、CD28单抗以及IL-17极化细胞因子组合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）诱导培养10-12d，收集细胞，经PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法检测γδ T细胞两个亚群产生IL-17的细胞数。 结果： 1、经刺激和诱导分化培养的γδ T细胞用ELISPOT方法检测产生IL-17的细胞数（每105个γδ T细胞）发现，抗TCR-γδ+CKs组（67±33）比抗TCR-γδ组（6±3）比明显增加（P＜0.01），抗TCR-γδ+CD28单抗+CKs组（185±54）与抗TCR-γδ+CKs组（67±33）比明显增多（P＜0.01）。Mtb-HAg+CD28单抗+CKs组（74±41）与抗TCR-γδ+CD28单抗+CKs组（185±54）比显著减少，但与Mtb-HAg+CD28单抗组（19±12）比明显增多（P＜0.05）。 2、纯化的γδ T细胞用含10%NBS的RPMI-1640或IMDM作为培养液进行培养，在相同的诱导极化条件下培养10-12d后ELISPOT检测发现，用IMDM培养液培养的组（333±46）产生IL-17的γδ T细胞数（每105个γδ T细胞）与用RPMI-1640培养液的组（56±38）比明显增多（P＜0.01）。 3、来源于新鲜的PBMC或冻存的PBMC经免疫磁珠分选得到的γδ T细胞在相同的诱导培养条件下培养10-12d后ELISPOT检测，来源于新鲜的PBMC经纯化后得到的γδ T经诱导极化产生IL-17的量明显高于比来源于冻存的PBMC（P＜0.01）。 4、复苏冻存的PBMC后免疫磁珠分选得到纯化的γδ T细胞，分别用含10%NBS的IMDM培养液和含10%人AB血清的IMDM培养液培养，在相同的诱导极化培养条件下培养10-12d后ELISPOT检测发现，含人AB血清的培养液组与含10%NBS的培养液组相比明显增多（P＜0.01）。 5、培养后Vδ2－γδ T细胞中Vδ3-8亚群所占比例＞50%时，Vδ2－γδ T细胞产生IL-17的细胞数（1537±1193）与Vδ2+γδ T细胞（579±420）相比明显增多（P＜0.05）。而培养后Vδ2－γδ T细胞中Vδ3-8亚群所占比例＜50%时，Vδ2－γδ T细胞产生IL-17的细胞数（491±745）与Vδ2+γδ T细胞（1729±1315）相比明显减少（P＜0.01）。 结论： 1、在正常健康人γδ T细胞经Mtb-HAg或抗TCR-γδ抗体激活后，诱导Th17分化的细胞因子（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）也能诱导IL-17+γδ T细胞分化。CD28在协同抗TCR-γδ抗体激活γδ T细胞诱导产生IL-17的过程中也有重要作用。 2、抗TCR-γδ抗体刺激诱导IL-17+γδ T细胞分化比Mtb-HAg的作用更强。 3、诱导人γδ T细胞产生IL-17时用IMDM培养液培养可产生更多的IL-17+γδ T细胞，提示其与芳香烃受体的参与有关。 4、在正常人外周血γδ T细胞中产生IL-17的细胞主要以Vδ3-8亚群为主，其次为Vδ2亚群，Vδ1亚群中最少。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R52
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 ;Interleukin 17-Producing γδ T Cells Increased in Patients with Active Pulmonary Tuberculosis[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年03期
2 伍璞;刘纯;;产生IL-17的γδT细胞概述[J];免疫学杂志;2012年05期
3 周晓薇;胡朝英;张冬青;;IL-17~+γδT细胞与疾病关联性的研究进展[J];生命科学;2013年01期
4 陈勇,李柏青;人γδT细胞TCR分子与结核杆菌多肽抗原特异性结合的证据[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年01期
5 牛海涛,张素梅,何维;卵巢癌患者γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2000年02期
6 吴俊英,张学光,李柏青;协同刺激分子CD28在结核杆菌抗原体外激活人外周血γδT细胞中的作用[J];中国免疫学杂志;2002年11期
7 王玫;任安;;Th17与自身免疫性疾病[J];国际病理科学与临床杂志;2012年03期
8 汤新逸;王胜军;;IL-17~+ γδT细胞[J];细胞与分子免疫学杂志;2011年07期
9 冯永波;周忠海;陈复兴;徐涛;徐晶;费素娟;;CD28单抗对γδT细胞增殖和杀伤胃癌细胞的增强作用[J];现代消化及介入诊疗;2013年01期
10 邱潮林;周晓薇;胡朝英;谢秋华;胡锦辉;赵蓉;钱柳;张冬青;;Vγ9Vδ2T细胞亚群的建立与功能分析[J];诊断学理论与实践;2013年02期
本文编号：
2227451
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/chuanranbingxuelunwen/2227451.html
