严重发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn的免疫原性研究

发布时间：2018-10-23 17:49

【摘要】：目的：研究SFTSV糖蛋白Gn的体液和细胞免疫原性。方法：1.参考SFTSV HB29病毒株的糖蛋白Gn编码基因(GenBank:HM745931.1),优化编码Gn的密码子,氨基酸序列保持不变。化学合成得到的野生型序列WSP-Gn经PCR反应分别在WSP-Gn的5’端和3’端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,在Gn的5’端和3’端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位点,然后将上述序列分别克隆到真核表达载体pJW4303,构建重组质粒pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn。化学合成得到的密码子优化型序列WSP-Gn-opt经PCR反应分别在Gn-opt的5’端和3’端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位点,克隆到pJW4303载体,构建重组质粒pJW4303-tPA-Gn-opt。2.以上述重组质粒和空载体pJW4303分别转染HEK293T细胞,收集转染细胞上清和裂解液,Western blot检测糖蛋白Gn的表达。3.将上述重组质粒及空载体p.1W4303以肌肉注射、活体基因导入方式免疫BALB/c小鼠,免疫时间点为第0、2、4、8周,分别在每次免疫前和第6、10周进行内眦采血收集血清。通过ELISA法检测各个时间点小鼠血清中特异性IgG、 IgG1、 IgG2a水平。4.通过生物信息学方法预测Gn的CTL表位肽,优选其中的16条(P1-P16)用Elispot方法筛选并进行后续研究。按上述方法分别于第0、2、4周免疫BALB/c小鼠,在第7、17、31、60、90天分批处死小鼠取脾细胞,用Elispot技术检测分泌IFN-γ的淋巴细胞。结果：1.酶切鉴定和基因测序正确,即成功构建SFTSV糖蛋白Gn表达质粒pJW4303-WSP-Gn, pJW4303-tPA-Gn和pJW4303-tPA-Gn-opt。2.糖蛋白Gn在293T细胞的表达：pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn编码Gn可在HEK293T细胞内表达；pJW4303-tPA-Gn-opt编码Gn在HEK293T细胞内表达并分泌到细胞外。3.体液免疫应答:pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt均能诱导BALB/c小鼠产生抗Gn特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体；pJW4303-tPA-Gn-opt诱导产生的特异性抗体较pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn免疫组出现时间更早、滴度更高,且IgG2a/IgG1接近1,其诱导的Th免疫应答更趋于平衡。4.CTL免疫应答：肽P1、P10能够刺激重组质粒免疫小鼠淋巴细胞分泌IFN-y,且P10相对于P1诱导的CTL免疫应答更强、持续时间更久；P1刺激组,pJW4303-WSP-Gn诱导的CTL应答较其它两组为优,P10刺激组,pJW4303-tPA-Gn-opt诱导的CTL应答较其它两组为优。结论：1.SFTSV糖蛋白Gn具有良好的体液免疫原性和细胞免疫原性；2.P1、P10是SFTSV糖蛋白Gn的CTL表位肽。
[Abstract]:Objective: to study the humoral and cellular immunogenicity of SFTSV glycoprotein Gn. Method 1: 1. Referring to the glycoprotein Gn encoding gene (GenBank:HM745931.1) of SFTSV HB29 strain, the codon encoding Gn was optimized and the amino acid sequence remained unchanged. The wild-type WSP-Gn was chemically synthesized by PCR reaction to introduce Hind 鈪，

本文编号：2290017