H9N2亚型禽流感北京燕雀分离株的致病性及传播力研究

发布时间：2018-11-20 20:38

【摘要】：禽流感病毒(AIV)多次爆发流行,H9N2亚型AIV是我国及世界许多国家禽类中的流行主型,常共存且进化活跃,对公共卫生的意义重大。目前,对我国境内H9N2亚型AIV研究尚比较缺乏,非常有必要加强对该亚型AIV的分布、进化、致病性及传播力等方面的研究。基于此,本研究主要对A/Brambling/Beijing/16/2012(H9N2禽流感病毒)的感染性、致病性及传播力进行研究,并建立一种同时对H5N1和H7N9亚型流感病毒进行快速检测的新方法。本研究为禽流感病毒致病机理、进化规律的深入研究提供有参考价值的实验数据,同时为新发病例提供监测及治疗方案的理论预测,对于应对未来可能出现的禽流感疫情具有非常重要的现实意义。第一部分H9N2亚型禽流感北京燕雀分离株的致病性及传播力研究H9N2禽流感病毒一直在家禽群体中流行,偶尔传播给人类。在对中国北方流感病毒的监测中,我们首次从北京燕雀肺组织中分离到一株H9N2禽流感病毒,并且其内部基因与感染人的H7N9病毒高度同源,该病毒命名为(A/Brambling/Beijing/16/2012),我们对其生物学特性进行了研究。首先,为了解病毒的进化地位,进行进化分析,显示该病毒的进化地位属于BJ/94-like(A/chicken/Beijing/1/1994)亚系,这表明H9N2 BJ/94-like亚系病毒可能是目前在中国北方流行的主要毒株。然后,为了解其体内感染力和致病性,我们开展了动物感染和传播研究,证实野生株病毒对鸡和小鼠具有较低的致病性;虽然在雪貂的鼻拭子和咽拭子中可以检测到高水平的病毒释放,但该病毒还没有获得在雪貂间通过空气传播的能力。随后,为研究该病毒的致病潜能,通过鼠肺传代适应,该毒株对小鼠的致病性上升很快,随着病毒在鼠肺中传代,毒力不断增加,并导致小鼠死亡。最后,为分析其致病原因,开展鼠肺适应株体外细胞感染实验,显示该病毒经过鼠肺适应后增加了对人源肺细胞的感染性,而且可在小鼠群体间进行有效传播。对P0,P12-1,P12-2,P12-3病毒进行了全基因组测序,发现在鼠肺传代过程中,病毒基因组内有3个位点的氨基酸发生了替换和病毒致病力密切相关。值得注意的是,在体外受体结合试验中,病毒只与人源α-2,6唾液酸受体结合,而不与禽源α-2,3唾液酸受体结合,这表明H9N2流感病毒具有潜在的公共卫生风险。因此,应加大在人群、家禽和野禽中H9N2禽流感病毒的监测力度,为其预警、预报提供依据。第二部分液相芯片方法同时检测流感病毒H5N1和H7N9亚型流感病毒存在混合感染情况,有文献报道,一位患者同时感染了两种甲型流感病毒株:H7N9和H3N2。我们前期的实验过程中也发现家禽分离的病毒样本其实是多亚型的混合物,而且环境中存在H5N1和H7N9共存的现象。这些情况都迫切要求对流感病毒各亚型做出早期、快速的实验室诊断。目前针对流行性感冒病毒的检测方法有多种,但尚未有一种方法能够快速简便的对流感病毒各种亚型进行区分。因此需要建立一种对流感病毒各种型别进行快速鉴定的新方法。本研究中我们基于液相芯片技术(Multiply Analyte Suspension Array,MASA),建立了一种对禽流感病毒H5N1和H7N9亚型进行快速检测的新方法。从数据库中下载所有A型流行性感冒病毒H5、N1、H7和N9片断核酸序列,筛选出需要的完整的核酸序列,利用生物学软件对序列进行比对分析,找出保守序列,根据保守序列设计引物和探针,最后将设计合成的各种探针与不同编号的微球进行偶联,并进行实验过程和检测条件的优化,最终研制出了检测试剂盒。在本研究中我们利用该试剂盒检测禽流感病毒H5N1和H7N9亚型和其它常见亚型(H1N1、甲流H1N1、H5N2、BH3N2和H9N2)标本。检测H5N1和H7N9标本可获得较高的荧光强度,为阳性结果,而其它亚型标本检测为阴性结果,具有较好的特异性。在灵敏度试验中,对H5N1和H7N9亚型cDNA标本10倍系列稀释后进行检测,证明该方法的检测下限为5个拷贝。在重复性试验中,每个样本检测三次,证明该方法的重复性良好,检测系统非常稳定。本研究为开发出更为快速有效的检测其它各种流感病毒亚型的方法,提供了一条更为广阔的途径。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R511.7

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