稳定高表达对核苷（酸）类似物耐药HBV毒株肝癌细胞系的建立

发布时间：2018-11-21 21:03

【摘要】：核苷(酸)类似物治疗能快速有效地抑制HBV复制,延缓肝脏病变的进展,从而降低肝硬化和肝癌的发生率。但长期抗病毒治疗容易出现对核苷(酸)类似物耐药,导致治疗失败。对耐药机制的体外研究以及筛选新的针对耐药HBV毒株的抗病毒药物需要合适的体外研究模型。为建立稳定高表达耐核苷(酸)类似物HBV变异株肝癌细胞系,我们开展了以下工作：在研究的第一部分中,我们构建了8种HBV表达质粒,包括野生型质粒以及常见的7种耐不同核苷(酸)类似物的变异型质粒,以用于人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞系的转染研究和筛选稳定细胞系。选用野生型质粒进行细胞转染、潮霉素筛选、阳性克隆筛选、长期传代以及有限稀释纯化细胞克隆等步骤,筛选出一株表达野生型HBV稳定细胞株,建立及完善了筛选稳定细胞系的体系,以应用于后续耐药HBV稳定细胞系的筛选。在研究的第二部分中,我们应用第一部分工作中建立的筛选体系,经过大规模的筛选获得了一株高表达耐拉米夫定HBV稳定细胞株,并命名为HepG2-HS204V。采用Southern blot技术证实该细胞株胞内HBV复制水平显著高于HepG2.2.15细胞株,上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平显著高于HepG2.2.15,达10倍以上。胞外分泌的病毒颗粒水平与HepG2.2.15相似。该细胞株显示出预期的耐药表型特征,包括对拉米夫定耐药以及对阿德福韦敏感。采用Southern blot方法证实该细胞株内HBV基因序列以整合的形式存在；Northern blot的方法证实2.4/2.1kb的亚基因组RNA的转录水平明显高于HepG2.2.15,提示可能该细胞株产生高水平HBsAg的原因。最后我们用CsCl梯度离心分离细胞上清各组份,采用免疫电镜以及免疫印迹的方法证实该细胞株可以分泌完整的病毒颗粒以及不同形式的亚病毒颗粒。经过长期传代证明了其稳定的生物学特性。在研究的第三部分中,我们同样应用建立的筛选体系,筛选出一株高表达耐阿德福韦N236T变异HBV稳定细胞株,命名为HepG2-HS236T。同时筛选出一株表达耐阿德福韦A181V变异HBV稳定细胞株。采用Southern blot技术证实该细胞株胞内HBV复制水平显著高于HepG2.2.15细胞株,上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平显著高于HepG2.2.15,达5倍以上。胞外分泌的病毒颗粒水平与HepG2.2.15相似。表型实验显示了预期的表型耐药特征,即对拉米夫定敏感以及对阿德福韦的敏感性明显降低。HepG2-HS236T细胞株中同样发现了以整合形式存在的HBV序列,采用常规电镜也发现了存在于细胞上清液中的病毒颗粒。长期传代证实了其稳定的生物学特性。而表达耐阿德福韦A181V变异HBV稳定细胞株其病毒蛋白水平为HepG2.2.15 2-3倍左右,但胞内HBV复制水平以及胞外HBV DNA分泌水平较低。在研究的第四部分中,我们同样应用建立的筛选体系,筛选出一株耐恩替卡韦L180M+M204V+T184S变异型和一株L180M+M204V+M250L变异型HBV细胞株。但其胞内HBV复制以及胞外HBV DNA的分泌均较低,有待于进一步优化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R735.7;R512.62

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本文编号：2348251