基于高通量测序和代谢组学的艰难梭菌感染患者肠道微生态研究

发布时间：2018-12-19 16:09

【摘要】：第一部分综,综合性医院艰难梭菌感染流行病学特征及危险因素分析艰难梭菌是一种严格厌氧、革兰阳性芽孢杆菌,属于条件致病菌。在长期大量应用抗生素或者人体免疫力低下、肠道菌群紊乱的情况下艰难梭菌会过度增殖并释放毒素,引起以肠道病理损伤为主的感染性疾病,即艰难梭菌感染(Clostridium difficile Infection, CDI).在西方发达国家,艰难梭菌已超过耐甲氧西林金黄色葡萄球菌成为院内相关性感染的首要病原菌。高达20%-30%的抗生素相关性腹泻和近乎所有的伪膜性肠炎与之相关。近年来,随着艰难梭菌高毒力菌株(BI/NAP I/027型)的出现,该病的严重病例数、复发率和病死率均明显增高。鉴于中国人口众多,抗生素广泛使用及人口老龄化的形势,CDI极有可能成为威胁公共健康的流行性疾病之一,应加强艰难梭菌感染监测。本研究一方面对我国一家综合性医院腹泻患者进行艰难梭菌分离鉴定、毒素分类及MLST分型研究,从来自不同科室的1845例腹泻患者粪便中分离出产毒艰难梭菌161株；科室间产毒艰难梭菌的分离率存在差异,ICU和老年病科的分离率较高；艰难梭菌A+B+型检出率为83.2%(134/161),A-B+型检出率为16.8%(27/161),二元毒素检出率仅为1.9%(3/161)；161株产毒艰难梭菌共分出31个ST型,其中ST-220是本研究新发现的ST型,ST-54、ST-35和ST-37为本研究菌株中的优势型别,ST-54型为23.0%(37/161), ST-35型为19.3%(31/161),ST-37型为10.0%(16/161),未检测到高产毒株ST-1(027型)和ST-11(078型)；不同的ST型别与毒素基因之间、科室间存在相关性,ST-37型的菌株均为A-B+,占本研究中A-B+菌株的59.3%(16/27),ST-54是老年病科、感染病科和血液病科的优势型别,但无证据提示研究期间院内发生CDI暴发流行。同时,我们还评估了CDI高危人群血液病科患者艰难梭菌的感染率,并结合病人的住院诊疗过程,进行了危险因素分析。化疗组和造血干细胞移植组分别分离到产毒艰难梭菌21株和14株,计算得到CDI累积发病率分别为1.89/1000和3.69/1000住院日；依托泊苷、氟喹诺酮类药物的使用与CDI发生相关；35株艰难梭菌共分出13个ST型,ST-54和ST-3为本研究菌株中的优势型别,未检测到高产毒株ST-1(027型)和ST-11(078型)。近80%的CDI发生于患者造血干细胞移植后的第1个月,提示广大医护人员应高度警惕CDI的发生。该研究为合理应用抗生素,预防CDI,提高诊疗效率并控制CDI的流行提供了参考。第二部分艰难梭菌感染患者肠道菌群结构多样性研究目前能有效治疗CDI的药物是万古霉素和甲硝唑,但治疗后3个月内两者的复发率在10%-30%左右。对于复发、难治性CDI,经常规治疗无效后可以考虑粪便菌群移植治疗,以恢复患者肠道菌群稳态,减少艰难梭菌定植。粪便菌群移植是现今治疗复发性、难治性CDI最有效的方法之一,治疗成功率可达83%-92%,这提示我们肠道菌群在治疗CDI及对预防其复发有重要的作用。然而,粪便菌群移植因可能存在未知风险,缺乏长期有效性和安全性研究、挑战患者心理承受能力等原因而没有被广泛推广。因此进一步明确粪便菌群中治疗CDI的关键细菌种类,提取肠道有益菌群是未来的重要发展方向。本研究利用16S rDNA测序法和荧光定量PCR法对15例CDI患者、18例非艰难梭菌感染院内腹泻患者(C. difficile-negative nosocomial diarrhea, CDN)和25例健康对照人群的粪便菌群结构进行了全面分析以寻找与CDI相关的关键细菌种类。三组间多样性参数比较和基于Spearman距离的主坐标分析结果都显示健康对照人群和CDI、CDN患者的肠道菌群结构具有显著差异。研究发现CDI患者与产丁酸相关的厌氧菌比例如毛螺菌科细菌、瘤胃球菌科细菌比例显著降低,与产乳酸相关的细菌比例则显著升高,与产内毒素相关的肠道潜在致病菌如肠杆菌科细菌比例明显增加,而具有抗炎作用的柔嫩梭菌类群及其中最具代表性的Faecalibacterium prausnitzii比例显著减少,这些菌群结构改变可能与增加艰难梭菌定植的易感性有关。我们的研究结果可以为以调节肠道菌群为治疗手段治疗CDI提供理论依据。第三部分艰难梭菌感染患者粪便上清代谢组学研究肠道微生态是人体最为重要的微生态系统,相当于一个重要的代谢“器官”。我们对于CDI患者肠道菌群结构的改变与代谢如何关联还知之甚少,因此要从代谢水平对艰难梭菌感染与肠道菌群关系进行深入探索。本研究通过超高效液相色谱-质谱代谢组学分析方法,对CDI、CDN患者和健康对照人群粪便上清的代谢物质进行检测。采用主成分分析、偏最小二乘法判别分析及正交偏最小二乘法判别分析对三组UPLC/MS数据进行代谢模式分析,结果显示CDI、CDN患者和健康对照人群代谢谱有显著不同。我们鉴定得到20种特征性代谢产物(主要是与胆汁酸代谢、胆红素代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢相关的代谢产物),并进行组间比较以确定统计学显著性。与健康对照者相比,CDI患者初级胆汁酸含量显著升高,而次级胆汁酸含量显著下降；胆素原显著减少,而与色氨酸代谢和脂肪酸代谢等相关代谢产物则显著升高。肠道菌群失衡造成的这种代谢环境可能与艰难梭菌定植和过度繁殖有关,有待进一步研究证实。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R516

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