可示踪的复制型HBV载体的构建及其生物学特性研究

发布时间：2019-02-15 04:56

【摘要】：乙型病毒性肝炎是一个全球性的健康问题,在全世界有超过3.5亿乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染者。迄今在乙型病毒性肝炎防治领域仍存在许多重大的、尚待解决的科学问题,如对HBV生活周期和复制过程的了解仍有限;HBV侵袭肝细胞的分子机制;慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的发病机制仍未完全阐明。HBV感染与复制模型是研究HBV生物学特性、探索抗HBV药物的新靶点、抗HBV药物耐药性的研究以及筛选新的抗病毒药物、评价新的免疫疗法和疫苗必不可少的重要工具。许多病毒通过插入外源基因,构建了复制型病毒载体,并且在分子生物学研究中发挥了重要的作用。如果把HBV改造为可示踪的复制型病毒载体,将可以大大提高新型抗HBV药物的研发效率,并有助于阐明HBV研究领域中许多尚待解决的科学问题。鉴于上述挑战,本课题利用本实验室前期构建的复制型HBV载体,结合荧光分子及荧光素酶报告基因最新进展,构建分别表达小分子荧光基团(miniSOG)、标准型Nanoluc~(TM)荧光素酶(Nanoluc Luciferase,Nluc)和分泌型Nanoluc~(TM)荧光素酶(Secretory Nanoluc Luciferase Sec Nluc)三种报告基因的复制型HBV载体,检测重组HBV生物学特性及其,感染能力。目的:利用miniSOG、Nluc、secNluc的报告特性,形成可示踪的,复制型重组HBV载体并检测其生物学特性及其感染能力。方法:1 PCR方法获得miniSOG、Nluc、secNluc全长序列。2利用基因重组技术,将所获得的miniSOG、Nluc、secNluc序列,亚克隆至本实验室先前构建的复制型载体pCH-rep中,构建如下3个质粒:pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc。以我实验室先前构建的带有四环素调控元件和潮霉素抗性基因的野生型pTRE-HBV-C7-5为母体质粒,将HBV部分替换为上述表达报告基因的HBV-miniSOG、HBV-secNluc,获得pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc载体。3 pCH-miniSOG分别瞬时转染HepG2、293、Huh7细胞系,以本实验室先前构建的HBV复制型载体pCH-hr GFP为对照,荧光显微镜下观察转染后72小时细胞内荧光强度。4质粒pCH-3093、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pCH-miniSOG及携带杀稻瘟菌素抗性基因(Blasticidin Regene,Bsd R)和人源绿色荧光蛋白(Humanized Green Fluorescent Protein,hr GFP)的载体pCH-Bsd R、pCH-hr GFP分别转染HepG2细胞,转染后72小时,提取细胞总核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA),Northern blot检测HBV RNA的表达。5将上述6种质粒分别转染HepG2细胞,转染后72h提取细胞内总蛋白,使用9H9和4/7B表面抗原(HBs Ag)的混合抗体,Western blot检测HBV囊膜蛋白的表达(Pre S1、Pre S2、S)。使用mc-312抗体,Native western blot检测核心蛋白表达情况。6将上述6种质粒分别转染HepG2细胞,化学发光法分别定量检测细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBs Ag)与乙型肝炎e抗原(patitis B e-antigen,HBe Ag)表达。7将上述6种质粒及pTRE-3093、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc、PTRE-HBV-hr GFP分别瞬时转染HepG2细胞,提取脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),Southern blot检测重组体复制中间体的表达。8将上述6种质粒分别转染HepG2细胞,转染后72小时提取细胞上清液,细胞培养上清液用内切酶Dpn I、DNase I及核酸酶预处理,实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒载量(Hepatitis B virus deoxyribonucleic acid,HBV-DNA)。9 pCH-Nluc、pCH-secNluc分别瞬时转染HepG2细胞系。使用promega的Nano-Glo?Luciferase检测试剂在转染后不同时间点(24h、48h、72h、96h、120h)监测细胞内Nluc及细胞培养液中secNluc活性。10将pCH-secNluc载体瞬时转染hepG2细胞,收集病毒颗粒,感染Hepa RG细胞系,感染后不同时间(第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天)测定细胞培养上清液中荧光素酶活性,评价其感染能力。结果:1聚合酶连反应(ploymerase chain reaction,PCR)成功扩增出了miniSOG、Nluc、secNluc三个片段。并插入复制型HBV载体构建了如下质粒:pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc,大小、酶切以及测序鉴定,与理论序列相同。2表达绿色荧光蛋白的复制型HBV载体荧光强度观察:转染后72h,荧光显微镜下观察,miniSOG与hrGFP在Hepa G2、Huh7、293三种细胞系内均见有荧光表达,miniSOG荧光强度要弱于hr GFP。3复制型HBV载体HBV RNA的表达:上述(方法-4)转染的复制型HBV载体均可见转录出HBV前基因组RNA(pregenomic RNA,pg RNA)和亚基因组RNA(Subgenomic RNA,sgRNA)。与野生型HBV比较,pg RNA大小均较大。4复制型HBV载体囊膜蛋白的表达:上述(方法-4)转染的复制型HBV载体均检测到与野生型HBV相似的大、中、小蛋白。5复制型HBV载体核心蛋白的表达:上述(方法-4)转染的复制型HBV载体均检测到HBV核心蛋白的表达,与野生型HBV相似。6复制型HBV载体Hbs Ag与HBe Ag的表达:上述(方法-4)转染的复制型HBV载体与野生型HBV载体比较,HBs Ag与HBe Ag在细胞培养上清中的定量水平相似,无统计学差异(P0.05)。7 Southern blot检测分析复制型HBV载体在细胞外和细胞质内HBV DNA表达情况:与野生型HBV比较,携带Bsd R(399bp)、miniSOG(312bp)的复制型HBV载体无论是在细胞外还是在细胞质内复制水平下降不明显,而携带Nluc(513bp)、secNluc(597bp)、hr GFP(720bp)载体HBV复制能力较弱。8复制型HBV载体分泌HBV DNA的检测:与野生型HBV比较,上述(方法-4)转染的各重组复制型HBV载体在细胞培养液中HBV-DNA,分泌水平有所下降(P0.05),但仍能达到10~6 copies/m L以上。9荧光素酶分析:pCH-Nluc,pCH-secNluc转染Hepa G2细胞,于24h、48h、72h、96h、120h分别监测细胞内及细胞培养液中荧光素酶表达活性,在不同时间点,荧光素酶的信号强度不同。在24h、48h、72h逐渐上升,在72h时Nluc发光值可高达4.5ⅹ10~9以上,secNluc发光值可达2ⅹ10~9以上,96h开始有下降趋势,但仍处于较高水平。10 HepRG细胞感染实验:表达secNluc的病毒感染HepRG细胞后,分别在第0、2、4、6、8、10天监测荧光素酶活性,于第6天荧光素酶活性最高,可达10~6水平,第8天仍保持此水平,第10天开始下降。结论:成功构建了带有报告基因的重组HBV载体:pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNLuc。通过对复制型HBV载体生物学特性检测,证明了携带报告基因的复制型HBV载体具备一定的复制、表达能力,所形成的重组HBV具有感染性。通过可易观察的荧光蛋白和灵敏的荧光素酶检测,将有助于HBV分子生物学研究及抗HBV药物筛选。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62

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