弓形虫毒力因子ROP18激酶的致病分子机制研究

发布时间：2019-03-31 10:50

【摘要】：背景：弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，可以感染几乎所有的温血动物，会引起世界范围内传播的人兽共患病。免疫功能正常人群感染弓形虫不会出现明显症状，但免疫功能低下或缺陷者感染弓形虫则会引发严重的并发症，目前弓形虫感染已经成为AIDS和器官移植患者重要死亡因素之一。基因组数量特征分析、转基因弓形虫实验及菌株杂交实验均证明ROP18能提高弓形虫的增殖速率，对感染动物有致死作用，因此，ROP18是弓形虫重要的毒力因子，，本研究采用酵母双杂交方法筛选与ROP18相互作用的宿主蛋白，通过免疫沉淀、GST-pull down、酵母共转以及免疫荧光进一步证实ROP18与宿主NF-κB p65的相互作用，提示ROP18可能通过宿主NF-κB发挥其致病作用，为弓形虫病致病机制研究提供依据。目的：采用酵母双杂交法筛选与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的蛋白及ROP18与NF-κB p65相互作用的鉴定，为弓形虫致病机制研究提供依据。方法：本实验分为两部分：（1）RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段，扩增产物经双酶切后插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母AH109菌株中，检测诱饵载体是否有毒性和自激活作用，利用酵母双杂交从人胚胎脑cDNA文库中筛选与ROP18相互作用的蛋白；（2）RT-PCR扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因片段，扩增产物经双酶切后插入PCR blunt II Topo vector构建pROP18，从pROP18扩增出ROP18编码序列，将纯化的PCR产物克隆至pTUB8-mycGFPPftailTY，构建pTUB8-ROP18-TY质粒，将质粒电穿孔转染弓形虫RH株，弓形虫悬浮液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养，用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM筛选高表达ROP18的弓形虫RH株，收集虫体，腹腔注射昆明小鼠，免疫荧光检测ROP18在转基因弓形虫株中的表达，吉姆萨染色比较RH株与高表达ROP18的RH株的细胞增殖速率，酵母共转、GST-pull down及免疫共沉淀证明ROP18与p65之间存在相互作用，免疫荧光双标实验观察ROP18与宿主p65共定位。结果： 1.ROP18相互作用的宿主蛋白的筛选 1）酶切鉴定表明质粒构建成功。 2）用玻璃珠（美国Sigma公司）法提取转了质粒pGBKT7-ROP1825 251aa的酵母蛋白， WB检测显示ROP18蛋白表达，阴性组不表达。 3）发现ROP18全长具有自激活功能，因此用ROP1825-251aa为诱饵，筛选获得一系列与ROP18相互作用的宿主蛋白：NF-κB p65蛋白、DNA损伤特异性结合蛋白1（DDB1）、转录激活因子ATF6β、torsinA相互作用蛋白1（TOR1AIP1）、溶质运载蛋白3（SLC3A2）、Derl样域家族成员2（DERL2）、酪氨酸硫化转移酶2（TPST2）、OCIA结构域蛋白1（OCIAD1）和整联蛋白β1（integrinβ1）。 2.ROP18与NF-κB p65相互作用的鉴定 1）将转基因弓形虫感染后的细胞固定和抽提以后，染Ty1鼠mAb（绿色）、DAPI（蓝色），重叠图像表明在弓形虫顶端的棒状体附近有ROP18蛋白表达。 2）吉姆萨染色证明ROP18过表达弓形虫株较RH株弓形虫增殖快，ROP18能够促进弓形虫在细胞内的增殖。 3）酵母共转：将p65构建到pGADT7载体，然后与ROP18的酵母表达载体共转至酵母AH109菌株，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养基上验证，结果表明p65是通过二聚化结构域与ROP18相互作用。 4）细胞免疫荧光：将ROP18过表达的弓形虫感染后的HFF细胞固定和抽提以后，共染Ty1鼠mAb（绿色）、p65兔mAb（红色）、DAPI（蓝色），重叠图像表明弓形虫ROP18和宿主NF-κB p65共定位于宿主细胞质。 5）免疫共沉淀：将ROP18-Δ27-GFP与GFP分别转染293t细胞，用GFP抗体沉淀细胞裂解液中的p65，免疫沉降物经SDS-PAGE，转移到NC膜上，分别用GFP和p65抗体杂交，发现p65存在于ROP18-Δ27-GFP的免疫复合物中，因此p65和ROP18可以在细胞内发生相互作用。 6）GST-pull down：将纯化后的带GST标签的ROP18蛋白与带HIS标签的p65-M蛋白进行GST-pull down实验，发现p65-M能与ROP18直接相互作用，进一步验证p65是通过二聚化结构域与ROP18相互作用。结论：（1）通过酵母双杂交技术筛选出与弓形虫毒力因子ROP18相互作用的多种宿主蛋白。（2）高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫可遗传系统构建成功。（3）ROP18与NF-κB p65相互作用。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R531.8

【参考文献】