干扰素调节的miRNA表达谱及其抗HCV机制研究

发布时间：2019-04-18 11:17

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是严重威胁人类健康的病原微生物之一。人类感染丙型肝炎病毒后,常发展为慢性感染及肝硬化、肝细胞癌等严重肝病,对人类的生活质量构成严重威胁。目前干扰素(Interferon, IFN)联合利巴韦林(ribavirin, RBV)是治疗HCV感染的标准疗法。而这种疗法并不是对所有患者有效,并且常引起严重的副作用。2009年,多项研究表明IL-28B,作为Ⅲ型干扰素家族成员之一,其个体基因多态性与HCV感染的干扰素治疗效果密切相关,期望可以将IL-28B的遗传变异作为预测干扰素治疗结果的重要生物标记物。 miRNA是长度在22个核苷酸左右的非编码RNA,是基因转录后负向调控因子。干扰素是哺乳动物抗病毒免疫的关键成分。ISG被认为是干扰素发挥抗病毒功能的主要效应因子,对干扰素抗病毒机制的研究也多集中于ISG,鲜有关于Ⅰ型和Ⅲ型干扰素调节miRNA表达的研究,对miRNA参与干扰素抗病毒的研究也较少见。因此,本论文主要对Ⅰ型和Ⅲ型干扰素所调节的：miRNA表达谱进行研究,揭示两种干扰素调控miRNA表达的异同,并且阐述干扰素调节的miRNA抗HCV的功能和机制,为HCV感染新疗法的研发提供新的靶点。 本研究首先对酵母表达系统生产得到的人源IL-28B重组蛋白(recombinant human IL-28B, rhIL-28B)进行了抗病毒、信号通路激活、受体分布等特性的鉴定。rhIL-28B可以有效抑制HCVcc (cell culture derived-HCV)在肝癌细胞Huh7.5.1中的增殖,并能与利巴韦林协同抗病毒。IL-28B通过与受体IL-10R2和IL-28R1结合,有效激活JAK-STAT信号通路,诱导磷酸化STAT1和ISG (IFN-stimulated genes)的表达。而特异性识别受体IL-10R2和IL-28R1的抗体能够抑制IL-28B的抗病毒效果。通过检测不同细胞类型中干扰素激活ISG的情况,我们发现IL-28B只特异性识别肝、肺、前列腺、结肠癌等细胞类型,而IFN-α对多种细胞类型具有广谱嗜性。因此,有效的抗HCV活性和有限的细胞类型嗜性等特点,使IL-28B有可能成为治疗HCV感染的有效候选因子。 为了揭示Ⅰ型和Ⅲ型干扰素调节的miRNA表达谱是否相同,本研究利用荧光实时定量PCR技术检测了IFN-α和IL-28B处理对肝细胞miRNA表达谱的影响,并且重点分析了两种干扰素诱导miRNA表达的异同。我们发现160个]miRNA的表达水平发生了变化,其中既有Ⅰ型和Ⅲ型干扰素共同调节的miRNA,也有差异调节的miRNA。这种差异即体现在miRNA变化的程度上,还体现在miRNA表达变化的方向上。我们对这些miRNA的抗病毒活性进行了筛选,发现let-7b可以显著抑制HCV感染,并且存在剂量和时间梯度依赖性。突变let-7b5'端的6-8bp的种子序列,会影响let-7b的抗病毒活性。let-7b与其他已知的HCV抑制药物联合使用能增强let-7b的抗病毒功能。进一步研究发现let-7b主要通过抑制HCV蛋白翻译和复制来抑制病毒增殖。 miRNA可能通过打靶病毒基因组抑制病毒感染,也可能通过打靶宿主基因影响病毒的生活周期。通过机制分析我们发现let-7b可以直接与HCV基因组相互作用抑制病毒复制。此外,IGF2BP1(insulin-like growth factor2mRN A-binding protein1)是HCV复制的正向调控因子。let-7b能够识别IGF2BP1的mRNA序列,并降低其表达水平,进而影响HCV的感染。let-7家族成员具有相同的种子序列,均可以抑制IGF2BP1的表达和HCV复制。需特别指出的是,降低let-7b的表达水平可有效减弱IFN-a和IL-28B的抗HCV效果。由此我们推测let-7b参与Ⅰ型和Ⅲ型干扰素的抗病毒过程。 综上所述,我们通过检测IL-28B的抗病毒效果、信号通路激活和细胞种类亲嗜性,发现IL-28B具有有效的抗HCV活性和有限的细胞类型亲嗜性,进一步确定了IL-28B作为新的抗HCV药物的潜在特质。通过对Ⅰ型和Ⅲ型干扰素调节的肝细胞miRNA表达谱进行研究,发现既有Ⅰ型和Ⅲ型干扰素共同调节的1niRNA,也有两种干扰素差异调节的miRNA.对干扰素调节的miRNA进行抗病毒活性检测,发现let-7b可以显著抑制HCV复制和翻译。重要的是我们发现let-7b受Ⅰ型和Ⅲ型干扰素调节,参与到干扰素的抗病毒功能中。let-7b即可以直接与HCV基因组相互作用抑制病毒复制,也能够通过降低宿主因子IGF2BP1表达水平,间接影响HCV的感染。这些研究结果进一步提示miRNA和Ⅲ型干扰素在宿主抗病毒免疫应答方面的重要性,为研发治疗HCV感染的新疗法的提供了新的靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.63;R3411

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本文编号：2460002