FGF2在甲型H1N1流感病毒感染肺损伤中的作用机制研究

发布时间：2019-05-23 19:18

【摘要】：甲型H1N1流感病毒感染人体能够造成严重的急性肺损伤,具有较高的发病率和致死率。甲流感染伴有多种细胞因子水平升高,这些因子在肺损伤中的作用机制也陆续被揭示。有研究发现,在多个组织损伤和炎症模型中均检测到有FGF2细胞因子水平升高,然而目前关于FGF2在流感诱导的急性肺损伤中的作用机制还未曾有报道。FGF2是一个多效性的细胞因子,不仅能够促进细胞增殖、血管生成,而且参与组织损伤修复,诱导胚胎发育等多种生物学过程。本研究试图探究FGF2在甲型H1N1流感病毒感染引起的急性肺损伤中的作用机制。首先分析了甲型H1N1流感患者体内以及甲型H1N1流感病毒(A/Beijing/501/2009)感染致小鼠肺损伤模型中FGF2分子的表达水平,结果表明甲流患者血清中FGF2水平显著高于正常人群,在小鼠肺泡灌洗液中FGF2的水平呈显著上升趋势。A/Beijing/501/2009感染致小鼠肺损伤模型中,用FGF2中和抗体干预后,发现小鼠肺损伤更为严重,体重和存活率下降,其中早期抗体干预比晚期干预小鼠发病更为严重。同样的,FGF2缺陷小鼠表现出对A/Beijing/501/2009以及A/Puerto Rico/8/1934流感病毒更为易感,小鼠肺损伤更重、死亡率更高。相反,用FGF2重组蛋白给药后,小鼠病情减轻,存活率明显上升。以上这些结果表明,FGF2在甲型H1N1流感病毒诱导的急性肺损伤中起保护作用。进一步研究发现,FGF2缺陷小鼠感染甲型H1N1流感病毒后,早期肺泡灌洗液中炎性细胞的募集量明显少于野生型小鼠,其中主要以中性粒细胞和巨噬细胞为主。同时还发现,在FGF2缺陷小鼠肺泡灌洗液中,多种细胞因子水平显著低于野生型小鼠,综合表现出FGF2敲除后不能激发有效的保护性炎症应答。以上结果预示着FGF2敲除后这些有差异的炎性细胞和细胞因子可能在流感感染致小鼠死亡的早期发挥着重要的保护功能。此外,在FGF2缺陷小鼠肺组织中检测到较高的病毒载量,而FGF2给药治疗能够降低小鼠肺部病毒载量。最后,我们还发现FGF2主要分泌细胞来源是肺上皮细胞,而非中性粒细胞或者巨噬细胞。进一步研究FGF2介导的肺损伤中下游信号通路发现,FGF2极有可能参与了P38介导的MAPK信号通路,预示着该信号通路的激活很可能在保护小鼠感染缓解肺损伤中发挥重要作用。近年来,关于mi RNA和炎症应答关系的研究已经成为感染免疫中研究的热点,但目前对于mi RNA在甲型H1N1流感病毒感染中的作用机制仍然知之甚少。是否存在关键的mi RNA在甲型H1N1流感病毒感染中发挥重要功能还不得而知。通过检测甲型H1N1流感病毒感染诱导mi RNA的表达水平,我们发现甲型H1N1流感病毒感染能够造成mi RNAs表达紊乱。将表达显著下调的mi RNA对FGF2靶基因进行预测,筛选并验证了能够显著抑制FGF2基因表达的mi RNA,包括mi R-194-5p、mi R-25-3p、mi R-92b-3p、mi R-361-5p、mi R-15b-5p、mi R-22-3p、mi R-17-5p、mi R-503-5p和mi R-16-5p。进一步验证抑制倍数在2倍以上的mi RNA对FGF2 3’UTR的作用,我们构建了6个FGF2 3’UTR短片段,分别检测了对应mi RNA的作用,同时我们也构建了每个mi RNA在3’UTR上对应的突变质粒,找到了mi RNA与FGF2 3’UTR的具体结合位点。研究发现mi R-194-5p、mi R-361-5p、mi R-92b-3p、mi R-25a-3p、mi R-16-5p、mi R-15a-5p、mi R-15b-5p和mi R-503-5p这8个mi RNA与FGF2 3’UTR有直接的作用,而作用位点即每个mi RNA对应的3’UTR上突变的位点。此外,在细胞和小鼠模型中验证了这些mi RNA的表达水平,并且验证了这些mi RNA的功能,找到了关键的mi RNA调节FGF2介导的肺损伤保护过程,而mi RNA的拮抗剂又能够治疗流感感染引起的小鼠肺损伤,因此,研究mi RNA也为甲型H1N1流感病毒感染造成急性肺损伤的治疗提供了新的研究方向。分泌型FGF2与细胞表面高亲和力受体(FGFR)结合后,能够促进受体二聚化,激活胞内酪氨酸激酶活性,导致下游多条信号通路的活化。FGFR包括FGFR1-4四个成员,属于酪氨酸激酶受体亚家族。有研究发现用广谱酪氨酸激酶抑制剂能够促进流感病毒的复制,然而FGFR家族各成员是否也参与了流感病毒的复制还不是很清楚,它们是否参与了FGF2介导的肺损伤保护机制也有待研究。我们用甲型H1N1流感病毒(PR8和H5N1)感染人肺上皮细胞A549,检测了四种受体成员的表达水平,发现FGFR1和FGFR4表达丰度较高,而FGFR2和FGFR3表达相对较少,病毒感染后造成FGFR1和FGFR4表达显著下调。进一步用si RNA介导的基因表达沉默,确定了FGFR1敲除能够显著促进甲型流感病毒的复制,而FGFR4却没有该效应。相反,由慢病毒介导的FGFR1过表达能够抑制流感病毒复制,而FGFR4不具有该效应。另外,PR8感染不仅能够下调FGFR1蛋白水平,而且能够下调其磷酸化水平。用FGFR1选择性抑制剂PD173074能够明显促进流感病毒的复制,说明FGFR1激酶活性对流感病毒复制有很重要的影响。进一步,我们还发现FGFR1敲除能够明显促进流感病毒早期侵入,通过研究FGFR1对病毒结合和进入细胞过程的影响,我们发现FGFR1对病毒结合细胞表面没有影响,而是对病毒内吞过程有抑制作用,这种效应在PR8和H5N1上都得到了验证。我们的研究结果证明了FGFR1在流感感染过程中的重要作用,提示着该受体很可能参与了FGF2介导的肺损伤保护机制。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R511.7

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本文编号：2484156