结核分枝杆菌RD12区和RD5区特异性抗原的生物信息学分析及免疫原性初步评估

发布时间：2019-09-28 14:57

【摘要】：目的：中医对结核病（Tuberculosis，TB）在唐朝就形成了“痨虫”之说，1882年罗伯特·科赫发现了结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB），证明了“痨虫”即为MTB是TB的发病原因。为了进一步发展中医对TB的认识，我们采用现代技术和方法对MTB进行深入研究；本论文采用生物信息学和免疫学对MTB的RD12和RD5区抗原进行评估，从而为中西医结合在肺痨方面的发展提供实验室研究依据。 方法：在NCBI数据库上查询并获得各个抗原的氨基酸序列，用Blast分析其与MTB复合群及人类蛋白的同源性。利用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC数据库预测并分析MTB的RD12区和RD5区抗原CD8+T细胞表位的分布情况；利用NetMHC数据库预测并分析MTB的RD12区和RD5区抗原的CD4+T细胞表位的分布情况。然后，综合CD4+T和CD8+T表位预测，筛选出优势表位肽段。用pET32a载体和pET28b载体分别与RD5区抗原Rv3117和RD12区抗原Rv2074构建重组载体，用原核表达出结核特异性抗原，通过Ni-NTA柱纯化蛋白，利用Triton X-114在4℃能与水混溶，而在37℃能与水形成水相与去污相的特点，用相分离法去除Rv3117和Rv2074蛋白中的内毒素，然后分别用显色基质鲎试剂法和BCA法测定目的蛋白的内毒素含量和蛋白质浓度。收集临床结核病患者和健康对照者的血清，用ELISA检测血清中抗结核特异性抗原Rv3117和抗Rv2074的体液免疫反应，筛选出特异性和敏感性较高的特异性优势抗原Rv3117。用纯化并去除内毒素的蛋白Rv3117免疫C57BL/6小鼠，Westernblotting检测小鼠血清中抗结核分枝杆菌Rv3117的IgG抗体；用酶联免疫斑点试验检测Rv3117诱导C57BL/6小鼠脾脏淋巴细胞产生特异性IFN-γ的斑点形成细胞数（SpotForming Cells, SFC）；进一步收集临床活动性结核患者和健康对照的全血，并分离外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononμclear Cell, PBMCs），，用ELISPOT试验检测Rv3117分别刺激结核病患者和健康对照PBMCs产生特异性IFN-γ的SFC。 结果：通过预测与分析，并综合CD4+T和CD8+T预测结果，初步筛选出MTB RD12区4个抗原的13个优势表位肽段；RD5区5个抗原的23个优势表位肽段。本文选择结核分枝杆菌RD12区特异性抗原Rv2074和RD5区特异性抗原Rv3117以及公认的具有较强免疫原性的抗原CFP-10和ESAT-6，分别对65例结核病（Tuberculosis, TB）患者的血清和59例健康对照患者的血清进行抗结核抗体检测，结果显示RD5区抗原Rv3117能够引起65例TB患者血清IgG水平提高，与59例健康对照者相比，具有显著性差异（p0.05），并且其诱导产生IgG水平的敏感性/特异性(26.20%/98.30%）与CFP-10（24.60%/94.90%）、ESAT-6(24.60%/96.60%)相当；而RD12区抗原2074不能引起TB患者和健康对照者的显著性差异（p0.05）。 酶联免疫斑点试验结果显示0.10μg/mL、1.00μg/mL和10.00μg/mL的Rv3117均能引起小鼠脾脏淋巴细胞产生较高水平的Rv3117抗原特异性IFN-γ，与对照组CFP-10免疫的小鼠脾脏淋巴细胞相比，二者具有统计学差异（p0.05）。反之，不同浓度的CFP-10刺激CFP-10免疫的C57BL/6小鼠CFP-10抗原特异性T细胞产生释放IFN-γ，而对Rv3117免疫的C57BL/6小鼠产生CFP-10抗原特异性的T细胞释放IFN-γ无作用。 临床病例标本的实验显示，用20.00μg/mL的Rv3117分别刺激TB病人和健康对照者的PBMCs，Rv3117在区分TB患者组和健康对照组PBMCs产生的抗原特异性IFN-γ水平之间无统计学意义（p0.05）。采用不同浓度的Rv3117刺激TB患者（n=17）PBMCs释放抗原特异性IFN-γ水平实验显示，1.00~20.00μg/mL的重组Rv3117不能刺激TB患者产生IFN-γ（p0.05）。 结论：借助现代技术和方法对中医关于结核病的“痨虫”假说进行深入探讨是发展中医进一步认识“痨病”和“痨虫”本质的必要手段。本课题采用生物信息学和免疫学对MTB的RD12和RD5区抗原进行评估，初步评估出了结核特异性抗原Rv3117，虽然Rv3117不能作为抗结核诊断的免疫学指标，但其作为仅存在于MTB致病菌株H37Rv中的抗原，对其抗原免疫学功能的进一步研究有助于结核新型疫苗的研究和抗结核药物的开发，并对探索结核的致病机制具有十分重要的意义，为中西医结合预防、诊断及治疗结核病提供研究依据。
【学位授予单位】：河南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R52

【参考文献】

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本文编号：2543382