可溶性虫卵抗原和成虫抗原刺激日本血吸虫感染小鼠肠系膜淋巴结Th17细胞的免疫应答
发布时间：2019-10-17 20:53
【摘要】：目的研究可溶性虫卵抗原(SEA)和可溶性成虫抗原(SWA)刺激日本血吸虫(Schistosoma japonicum)感染小鼠肠系膜淋巴结(MLN)Th17细胞的免疫应答。方法新西兰大白兔2只,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(约1 000条/兔),45 d后收集成虫及虫卵,制备SWA和SEA。20只C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为感染组和健康组(10只/组),感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴,(40±5)条/鼠,感染后5~6周ELISA检测血清中SEA和SWA特异性IgG抗体。分离两组小鼠MLN中的淋巴细胞,均给予4种不同条件刺激:无刺激组(A组),SEA(100μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(B组),SWA(100μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(C组),抗-CD3 mAb(1μg/ml)+抗-CD28 mAb(1μg/ml)(D组)。培养9 h后,流式细胞仪检测Th17细胞;培养72 h后,ELISA检测细胞培养上清中的白细胞介素(IL-17)和γ干扰素(IFN-γ)。结果 ELISA检测结果显示,感染组小鼠血清SEA、SWA特异性IgG抗体的吸光度(A_(450)值)分别为2.66±0.20和1.68±0.66,高于健康组的0.19±0.05和0.25±0.12(P0.01)。流式细胞术检测结果显示,B组刺激后,感染组淋巴细胞中CD4~+IL-17~+和CD4~+IFN-γ~+细胞分别占0.43%和0.56%,高于健康组的0.05%和0.20%(P0.05);C组刺激后则分别占0.39%和0.76%,高于健康组的0.04%和0.19%(P0.05)。两组小鼠的淋巴细胞体外经SEA(B组)刺激后,感染组淋巴细胞产生的IFN-γ和IL-17分别为(49.13±14.71)和(41.73±2.42)pg/ml,高于健康组的(3.27±0.33)和(9.22±0.58)pg/ml(P0.01);经SWA(C组)刺激后则分别为(46.92±16.73)和(36.14±4.82)pg/ml,高于健康组的(3.38±0.34)和(8.78±0.93)pg/ml(P0.01)。B组的IL-17含量高于C组(P0.05)。结论SEA和SWA能体外诱导日本血吸虫感染C57BL/6小鼠肠系膜淋巴结的淋巴细胞分泌IL-17和IFN-γ,SEA刺激淋巴细胞产生IL-17的含量明显高于SWA;SEA和SWA均能诱导淋巴细胞分化为CD4~+IL-17~+细胞和CD4~+IFN-γ~+细胞。
【图文】：
中国寄生虫学与寄生虫病杂志2017年4月第35卷第2期ChinJParasitolParasitDisApr.2017，Vol.35，No.2a:P<0.01，b:P<0.05。图1ELISA检测日本血吸虫感染小鼠血清SEA（A）和SWA（B）特异性IgG抗体Fig.1SEA（A）andSWA（B）specificIgGinseraofmiceinfectedwithS.japonicumdetectedbyELISA蚴/只，感染面积约8cm×12cm，保留20min。45d后收集日本血吸虫成虫和虫卵，用于制备SWA和SEA。20只C57BL/6小鼠按随机表法随机分为感染组和健康组（10只/组)，感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（40±5）条/鼠。1.4血清采集与肠系膜淋巴结淋巴细胞悬液的制备小鼠感染日本血吸虫后第5～6周，眼球取血，分离血清。颈椎脱臼处死小鼠，无菌取肠系膜淋巴结，置于200目筛网中央，加1mlHank’s液，用注射器针芯研磨；用15ml离心管收集过滤的细胞悬液，，4℃、600×g离心8min，弃上清；10mlHank’s液重悬细胞，4℃、600×g离心5min；Hank’s液洗涤细胞2次后，用2mlRPMI1640完全培养液重悬细胞，立即用0.4％台盼蓝染色，显微镜下计数。1.5SWA和SEA的制备参照文献［7］的方法，将成虫和虫卵分别在冰浴上匀浆，超声10min，反复冻融3次，4℃、12000×g离心20min，收集上清液，即为SWA和SEA。分别用0.22μm滤膜过滤除菌，用多功能微孔板检测仪测定SWA及SEA的浓度并调整为5mg/ml。1.6流式细胞仪检测特异性抗原刺激细胞IL-17和IFN-γ的表达将健康组与感染组小鼠淋巴细胞密度分别调整为2×106/ml，分别给予4种不同的刺激：无刺激组(A组)，SEA（终浓度100μg/ml）+抗-CD28mAb（1μg/ml）（B组），SWA（终浓度100μg/ml）+抗-CD28mAb（1μg/ml）（C组），抗-CD3mAb（1μg/ml）+抗-CD28mAb（1μg/ml）（D组）。37℃?
0.34）和（8.78±0.93）pg/ml（P<0.01）；且B组刺激后感染组小鼠产生IL-17的水平明显高于C组（P<0.05）（图2）。2.3SEA和SWA刺激后特异性Th17细胞的检测流式细胞仪检测结果显示，SEA（B组)刺激后，感染组小鼠淋巴细胞产生的IL-17+CD4+T细胞占（0.39±0.03）%，IFN-γ+CD4+T细胞占（0.52±0.05）%，明显高于健康组的（0.04±0.01）%和（0.19±0.02）%（均P<0.05）；SWA（C组）刺激后为（0.33±0.02）%和（0.70±0.04）%，明显高于健康组的（0.02±0.01）%和（0.17±0.03）%（均P<0.05）（图3）。3讨论成虫和虫卵均能诱导宿主产生抗原特异性免疫效应，即针对血吸虫的抗感染免疫和对宿主脏器造成损害的免疫病理反应。目前认为日本血吸虫感染过程中对宿主影响最大、最主要的抗原是SWA和SEA。在抗血吸虫感染过程中，IgG抗体是抗感染的主要抗体，它具有调理作用，可增强吞噬细胞的吞噬功能。日本血吸虫感染所涉及的细胞应答是逐渐伴随着IgG抗体产生的过程。因此，本研究观察了日本血吸虫感染诱导的SEA和SWA特异性IgG·108·
【作者单位】： 广州市中西医结合医院检验科;广州市中西医结合医院外二科;广州医学院基础医学院病原学与免疫学教研室;
【分类号】：R532.21
本文编号：2550765
【图文】：
中国寄生虫学与寄生虫病杂志2017年4月第35卷第2期ChinJParasitolParasitDisApr.2017，Vol.35，No.2a:P<0.01，b:P<0.05。图1ELISA检测日本血吸虫感染小鼠血清SEA（A）和SWA（B）特异性IgG抗体Fig.1SEA（A）andSWA（B）specificIgGinseraofmiceinfectedwithS.japonicumdetectedbyELISA蚴/只，感染面积约8cm×12cm，保留20min。45d后收集日本血吸虫成虫和虫卵，用于制备SWA和SEA。20只C57BL/6小鼠按随机表法随机分为感染组和健康组（10只/组)，感染组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（40±5）条/鼠。1.4血清采集与肠系膜淋巴结淋巴细胞悬液的制备小鼠感染日本血吸虫后第5～6周，眼球取血，分离血清。颈椎脱臼处死小鼠，无菌取肠系膜淋巴结，置于200目筛网中央，加1mlHank’s液，用注射器针芯研磨；用15ml离心管收集过滤的细胞悬液，，4℃、600×g离心8min，弃上清；10mlHank’s液重悬细胞，4℃、600×g离心5min；Hank’s液洗涤细胞2次后，用2mlRPMI1640完全培养液重悬细胞，立即用0.4％台盼蓝染色，显微镜下计数。1.5SWA和SEA的制备参照文献［7］的方法，将成虫和虫卵分别在冰浴上匀浆，超声10min，反复冻融3次，4℃、12000×g离心20min，收集上清液，即为SWA和SEA。分别用0.22μm滤膜过滤除菌，用多功能微孔板检测仪测定SWA及SEA的浓度并调整为5mg/ml。1.6流式细胞仪检测特异性抗原刺激细胞IL-17和IFN-γ的表达将健康组与感染组小鼠淋巴细胞密度分别调整为2×106/ml，分别给予4种不同的刺激：无刺激组(A组)，SEA（终浓度100μg/ml）+抗-CD28mAb（1μg/ml）（B组），SWA（终浓度100μg/ml）+抗-CD28mAb（1μg/ml）（C组），抗-CD3mAb（1μg/ml）+抗-CD28mAb（1μg/ml）（D组）。37℃?
0.34）和（8.78±0.93）pg/ml（P<0.01）；且B组刺激后感染组小鼠产生IL-17的水平明显高于C组（P<0.05）（图2）。2.3SEA和SWA刺激后特异性Th17细胞的检测流式细胞仪检测结果显示，SEA（B组)刺激后，感染组小鼠淋巴细胞产生的IL-17+CD4+T细胞占（0.39±0.03）%，IFN-γ+CD4+T细胞占（0.52±0.05）%，明显高于健康组的（0.04±0.01）%和（0.19±0.02）%（均P<0.05）；SWA（C组）刺激后为（0.33±0.02）%和（0.70±0.04）%，明显高于健康组的（0.02±0.01）%和（0.17±0.03）%（均P<0.05）（图3）。3讨论成虫和虫卵均能诱导宿主产生抗原特异性免疫效应，即针对血吸虫的抗感染免疫和对宿主脏器造成损害的免疫病理反应。目前认为日本血吸虫感染过程中对宿主影响最大、最主要的抗原是SWA和SEA。在抗血吸虫感染过程中，IgG抗体是抗感染的主要抗体，它具有调理作用，可增强吞噬细胞的吞噬功能。日本血吸虫感染所涉及的细胞应答是逐渐伴随着IgG抗体产生的过程。因此，本研究观察了日本血吸虫感染诱导的SEA和SWA特异性IgG·108·
【作者单位】： 广州市中西医结合医院检验科;广州市中西医结合医院外二科;广州医学院基础医学院病原学与免疫学教研室;
【分类号】：R532.21
本文编号：2550765
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