丙氨酸氨基转移酶正常的慢性乙型肝炎患者病理学特征与miRNAs标志物的筛选研究

发布时间：2020-02-14 20:29

【摘要】：目前,慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)的国际治疗指南认为丙氨酸氨基转移酶(alamine transaminase,ALT)水平是反映肝脏组织学病变最重要的生化指标,通常情况下,ALT水平的升高是肝脏坏死性炎症的标志,也是抗病毒治疗的指标,而ALT水平正常(PNALT)的CHB患者则不需要给予抗病毒治疗,因为他们没有或只有轻度肝脏坏死性炎症的组织学改变。然而,最近的研究表明有28%-37%PNALT患者存在严重的肝脏损害程度,有些甚至是肝硬化或肝癌;另外,一些研究也表明血清ALT水平与一些CHB患者肝脏组织学病变程度的相关性较差,只依赖ALT水平对CHB患者治疗具有较大的局限性。因此,寻找比ALT水平更灵敏、更特异的生物标志物,是我们亟待解决的任务。微小RNA(MicroRNAs,MiRNAs)已成为近十年来分子生物学领域的研究热点,MiRNAs是一类长度约为19-22核苷酸非编码的单链小分子RNA,广泛存在于真核细胞中,成熟的MiRNAs通过与靶分子3'端非编码区(3'-UTR)的序列互补,在转录后水平上负调控靶基因的表达,参与了机体几乎所有重要的生理过程。此外,由于特殊的结构和存在方式,MiRNAs可以稳定地存在于血浆或血清中,抵抗RNA酶的降解,因此,外周血MiRNAs可能成为许多疾病一种新的理想分子标志物。最近大量研究也提供了明确的证据,表明miRNAs大量存在于肝脏,调节肝脏的很多相关疾病。然而,目前miRNAs是否能作为PNALT发生肝损伤的分子诊断标志物和参与调节机制的研究仍然不足。外泌体(exosomes)属于一种微小囊泡,其大小约为30～120nm,通过微囊泡(microvesicles,MVs)内陷生成,是多种细胞体内分泌的小囊泡体,内含生物活性蛋白,功能性RNA,miRNAs和其他非编码小RNA。有研究指出,细胞受损后产生的miRNAs分子能够转移至血液循环中,可介导机体对细胞受损后的反应过程。本研究旨在明确PNALT的CHB患者肝脏组织病理改变的发生率,并分析临床生化指标与这组人群肝损程度的相关性,探索是否可以找到预测PNALT患者显著性坏死性炎症和肝纤维化的临床生化指标;然后用高通量miRNAs表达芯片筛选出能够反应PNALT患者肝脏损伤更加稳定和灵敏的miRNAs分子标志物,在分子层面进一步完善指标体系,为这部分患者得到及时诊治提供全面的理论依据;最后在人肝星状细胞(human hepatitic stellate cells,HSCs)上清液中分离外泌体(exsome),检测exsome中血浆差异表达的miRNAs含量,探索血浆差异表达的miRNAs在HSCs的存在方式,探讨血浆差异表达miRNAs作为PNALT患者诊断肝脏损伤分子标志物的可行性。第一部分丙氨酸氨基转移酶持续正常(PNALT)的慢性乙型肝炎(CHB)患者临床病理学特征研究目的:明确PNALT患者中具有显著性坏死性炎症和肝纤维化的发生率;并分析临床生化指标与这组人群肝损程度的相关性,探索是否可以找到预测PNALT患者显著性坏死性炎症或肝纤维化的临床生化指标。方法:收集155例有肝穿刺活检的PNALT患者,分别对肝脏的坏死性炎症和纤维进行Knodell炎症活动指数和Ishak纤维化程度评分;用logistics回归分析临床参数和坏死性炎症及纤维化之间的关系以及采用接受者操作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析潜在预测因子的准确性。结果:评分结果显示PNALT患者中显著性肝脏坏死性炎症(Knodell炎症活动指数≥7)和肝纤维化(Ishak纤维化评分≥3)的分别占有36.5%和15.5%;根据单因素和多因素的 Logistic 回归分析显示:PLT(AUROC =0.905,cut-off值=171.5×109/ml)和GGT(AUROC =0.909,cut-off值=21.5U/1)水平可作为潜在中重度肝纤维化的独立性预测因素。结论:分别36.5%和15.5%的PNALT患者肝脏有显著性肝脏坏死性炎症和肝纤维化的组织学改变;可以通过PLT和GGT的水平预测PNALT患者肝脏纤维化的程度。第二部分丙氨酸氨基转移酶正常(PNALT)的慢性乙型肝炎(CHB)患者miRNAs标志物筛选的研究目的:miRNAs在血浆中异常表达的水平能够反映疾病的病理进程,因此可以成为许多疾病的诊断和预后的理想生物标志物;本研究旨在为肝脏组织学显示有显著性坏死性炎症和纤维化改变的PNALT患者筛选出稳定和敏感的miRNAs生物标志物。方法:采用miRNAs芯片技术在NPNALT(正常的ALT水平且没有显著性肝脏损伤患者)、SPNALT(正常的ALT水平但有显著性肝脏损伤患者)和Healthy(健康人群)三个独立样本组中进行miRNAs筛选;应用Taqman探针定量逆转录酶聚合酶链(qRT-PCR)方法在每组独立样本中和扩大样本中验证筛选得到差异表达的miRNAs,采用接收操作特性曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)来分析最终验证得到SPNALT差异表达的miRNAs作为诊断指标的准确性。结果:经miRNAs芯片筛选得到18种差异表达的miRNAs(fold change2.0或0.5,P0.05),Taqman 探针 qRT-PCR 方法验证最终得出 miR-122-5p 和 miR-151-3p可以作为SPNALT患者的诊断指标,AUC分析结果显示miR-122-5p和miR-151-3 p分别为0.901(95%可信区间,0.825-0.982;敏感性=80%,特异性=87%)和0.844(95%可信区间,0.745-0.943;敏感性=76.7%,特异性=87.3%)。结论:MiR-122-5P and miR-151-3P可能成为SPNALT稳定和敏感的分子生物诊断标志物,对PNALT的CHB患者早期诊断和治疗具有一定的价值。第三部分检测人肝星状细胞上清中血浆差异miRNAs的存在形式目的:观察第二部分SPNALT差异表达的miRNAs在人肝星状细胞上清中的存在形式,进而探讨血浆差异表达的miRNAs作为SPNALT分子诊断标志物的可行性。方法:低速旋转和高速离心法提取人肝星状细胞(HSC-LX2)的上清液,用Taqman qRT-PCR方法检测离心后外泌体(exosomes)沉淀,未离心的上清和离心后上清三组中SPNALT差异表达的miRNAs含量,运用方差分析和SNK方法对数据进行统计学分析。结果:miR-122-5p,miR-140-3p,miR-151a-3p 和miR-320d 4 种 miRNAs 在 HSC 细胞上清中均检出,且在exosomes中含量较高,ACt值分别为5.23±0.8,4.28±1.11,6.62±0.78和5.17±0.87,结果具有统计学意义(P0.05)。结论:miR-122-5p,miR-140-3p,miR-151a-3p 和 miR-320d 均以 exosomes 的形式存在于HSC-LX2上清中,提示miR-122-5p和miR-151a-3p作为SPNALT的分子诊断标志物具有可行性。
【图文】：

裕┑恼闲砸倚透窝祝ǎ茫龋拢┗颊叩牟±硌мo团z逡逑图２Ａ：经典的坏死性炎症病理组织学特征－肝脏汇管区大量的炎性细胞浸润伴界逡逑板性炎ＨＥ染仓（１０ｘ１０）逡逑ｔＰ餐余，

本文编号：2579607