Ⅰ-Ⅳ型登革病毒非结构蛋白NS1通用型单克隆抗体的制备及NS1抗原检测ELISA方法的建立

发布时间：2017-03-20 23:11

  本文关键词：Ⅰ-Ⅳ型登革病毒非结构蛋白NS1通用型单克隆抗体的制备及NS1抗原检测ELISA方法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：登革病毒(dengue virus, DV或DENV)可以感染人类并导致严重的临床疾病,引起的登革出血热和登革休克综合征病死率高。因些对登革病毒感染患者的早期诊断有很重要的意义。登革病毒非结构蛋白NS1具有较强的免疫原性,早期即可出现在感染了登革病毒的患者血清中,且出现时间早于IgM抗体,有研究表明其可以用于登革热的早期诊断以及病情监测。因此,NS1有望成为早期诊断登革病毒感染的方法。本课题研究利用生物信息软件分析四种血清型登革病毒NS1的抗原表位,选择四种血清型NS1蛋白中共同保守的抗原表位通过与小分子载体BSA偶联,通过免疫小鼠以及杂交瘤技术制备获得四个型别NS1通用型单克隆抗体23株。同时根据Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1蛋白基因序列设计特异性NS1引物,经RT-PCR得到四种型别的NS1全基因,并分别克隆到pMD19T载体上,随后,经BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切将目的片段进一步克隆到表达载体pET30a上,构建Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1蛋白BL-21高效表达菌株。表达菌株经培养和IPTG诱导,目的蛋白获得高效表达,四型表达产物经Western Blot鉴定后,进一步经过透析复性和蛋白纯化,制备获得重组I-IV型登革病毒NS1蛋白,浓度达2.7mg/ml。随后,利用制备获得的I-IV型登革病毒NS1通用单克隆抗体和重组的NS1蛋白建立ELISA检测体系,通过双抗夹心法成功建立了基于登革病毒NS1抗原的ELISA检测方法。
【关键词】：登革病毒 非结构蛋白NS1 单克隆抗体 重组蛋白 ELISA
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.8
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 前言9-14
• 第一部分 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒非结构蛋白NS1通用单克隆抗体的制备14-26
• 1 实验材料14-16
• 1.1 免疫抗原和检测抗原14
• 1.2 主要试剂14-15
• 1.3 实验动物15
• 1.4 主要实验材料15
• 1.5 主要实验仪器15-16
• 1.6 主要溶液配方16
• 2 实验操作与方法16-22
• 2.1 免疫抗原的选择和制备16-17
• 2.2 免疫动物17
• 2.3 小鼠免疫后经ELISA方法检测其血清效价17-18
• 2.4 制备饲养细胞18
• 2.5 杂交瘤细胞的制备18-19
• 2.6 单克隆细胞株的筛选19
• 2.7 腹水的制备19
• 2.8 腹水抗体的纯化19-20
• 2.9 抗体蛋白浓度的检测20-21
• 2.10 间接免疫荧光检测抗体特异性21
• 2.11 Western blots检测抗体特异性21-22
• 2.12 单克隆抗体稳定性的检测22
• 3 结果与分析22-24
• 3.1 免疫小鼠以及血清效价检测22
• 3.2 杂交瘤细胞的制备和筛选22-23
• 3.3 抗体的纯化23
• 3.4 免疫荧光法检测抗体23
• 3.5 Western blots检测抗体23-24
• 3.6 杂交瘤细胞株稳定性研究24
• 4 讨论24-26
• 第二部分 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1基因克隆、表达、纯化及鉴定26-44
• 1 实验材料26-28
• 1.1 病毒与细胞26
• 1.2 菌株26
• 1.3 载体质粒26
• 1.4 酶、抗体以及试剂盒26-27
• 1.5 主要的生物化学试剂27
• 1.6 主要实验仪器27
• 1.7 主要溶液配方27-28
• 2 实验操作与方法28-38
• 2.1 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒的获取28
• 2.2 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒核酸的提取28
• 2.3 病毒cDNA的获取28-29
• 2.4 Ⅰ-Ⅳ登革病毒非结构蛋白NS1全基因的获取29-30
• 2.5 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1-pMD19T载体的构建30-32
• 2.6 pET30a-NS1表达载体的构建32-34
• 2.7 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重组蛋白诱导表达条件的优化34-35
• 2.8 Ⅰ-Ⅳ登革病毒NS1重组蛋白的表达及纯化35-36
• 2.9 SDS-PAGE检测36-37
• 2.10 Western blots鉴定重组蛋白37
• 2.11 Ⅰ-Ⅳ登革病毒重组蛋白NS1免疫原性的检测37-38
• 3 结果与分析38-42
• 3.1 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1全基因的获取38
• 3.2 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1-pMD19T载体的构建及鉴定38-39
• 3.3 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒pET30a-NS1表达载体的构建及鉴定39-40
• 3.4 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重组蛋白诱导表达条件的优化40
• 3.5 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重组蛋白的纯化及鉴定40-41
• 3.6 Ⅰ-Ⅳ型登革病毒NS1重组蛋白免疫原性的检测41-42
• 4 讨论42-44
• 第三部分 登革病毒NS1抗原ELISA检测方法的建立44-51
• 1 实验材料44
• 1.1 实验试剂和材料44
• 1.2 主要实验器材44
• 2 实验操作与方法44-46
• 2.1 捕获抗体和检测抗体的选择44-45
• 2.2 确定最佳包板浓度、生物素检测抗体浓度以及亲和素抗体浓度45
• 2.3 双抗夹心检测方法的建立45
• 2.4 变异系数以及稳定性的初步检测45-46
• 2.5 最低抗原检出下限的测定46
• 2.6 特异性检测46
• 2.7 临床血清学检测46
• 3 结果分析46-50
• 3.1 捕获抗体和检测抗体的选择46
• 3.2 确定最佳包板浓度和生物素检测抗体浓度以及亲和素抗体浓度46-48
• 3.3 双抗体夹心检测方法的建立48
• 3.4 变异系数以及稳定性的初步检测48-49
• 3.5 最低抗原检测下限49-50
• 3.6 ELISA检测方法的特异性50
• 3.7 临床血清学检测50
• 4 讨论50-51
• 小结51-53
• 参考文献53-57
• 附录57-58
• 致谢58-59
• 个人简历59-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴培标;刘少群;杨少逵;王小英;许奕涛;;潮州市2008年登革热流行病学分析及防制对策[J];华南预防医学;2009年06期

  本文关键词：Ⅰ-Ⅳ型登革病毒非结构蛋白NS1通用型单克隆抗体的制备及NS1抗原检测ELISA方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：258635