糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机的初步探讨

发布时间：2020-03-19 00:17

【摘要】：目的:通过构建糖尿病兔、梅毒兔、糖尿病合并梅毒兔模型后,对比各实验组兔肾组织钙化情况并通过基因芯片筛选肾组织中与之相关的差异表达基因,再检测肾组织中钙化相关差异基因的蛋白表达情况,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机制。方法:1.实验动物分组及建模:将新西兰雄兔随机分成四组并构建正常组(C组)、糖尿病组(DM组)、梅毒组(TP组)和糖尿病合并梅毒组(H组)模型。2.HE染色:取各组兔肾组织石蜡切片脱蜡水化后用苏木精浸染,盐酸酒精分化,弱氨水返蓝和乙醇及二甲苯脱水最后中性树胶封片,观察各组实验兔肾组织的钙化情况。3.基因芯片检测:取各实验组兔肾组织进行基因芯片检测,筛选出差异表达的钙化相关基因。4.钙化相关差异基因的PCR检测:m RNA实时定量PCR检测各组实验兔肾组织中钙化相关基因表达的相对含量。5.钙化相关差异基因蛋白表达的免疫印迹(Western blot,WB)检测:提取肾脏组织蛋白测定浓度,配平后上样跑胶,0.05A恒流转膜45分钟,再用牛奶封闭1小时,孵一抗4度过夜,将膜放入TBST溶液洗膜后放入温箱孵二抗1小时,洗膜后显影,检测各组兔肾组织钙化相关差异基因蛋白的表达情况。6.免疫组化检测:取肾组织石蜡切片脱蜡水化,用3%过氧化氢(H2O2)去离子水孵育后用水冲洗PBS浸泡,通过5-10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭后再滴加一抗放入4度过夜之后用PBS冲洗,滴加二抗孵育后PBS冲洗,再滴加聚合物增强剂孵育后继续用PBS冲洗,显色后水洗然后复染、脱水、透明,最后封片。结果:1、糖尿病组(DM组)兔、梅毒组(TP组)兔和糖尿病合并梅毒组(H组)兔建模成功。2、HE染色结果显示:正常组兔肾组织没有明显的异常改变,TP组、DM组和H组实验兔肾组织均可见肾小球毛细血管扩张和近曲小管肿胀。并且DM组实验兔肾组织中集合管内和肾髓质区还可见蛋白管型、间质粘液样变、水泡样变。H组实验兔中肾近曲小管肿胀和肾小球毛细血管扩张更为严重,肾组织内钙盐沉积明显。3、基因芯片结果显示:肾上腺素受体α1A(ADRA1A)、R型电压依赖性钙通道Ca V2.3(CACNA1E)、胆囊收缩素A受体(CCKAR)基因在各实验组兔肾组织中的差异显著,与正常组相比,ADRA1A、CACNA1E、CCKAR基因含量在TP、DM、H组肾脏中上调,在TP组少量上调,DM组上调明显,H组上调最高。4、ADRA1A、CACNA1E、CCKAR基因m RNA实时定量PCR结果显示:与C组相比,ADRA1A、CACNA1E基因在TP、DM、H组肾脏中的表达量均上调,DM、H组的表达量比TP组高,H组中的表达量最高(其PCR表达量趋势与基因芯片结果相符)。与C组相比,CCKAR基因在TP、DM、H组肾脏中的表达含量均上调,DM、H组中的表达量比TP组高,但H组与DM组相比表达无差异。Toll样受体4(TLR-4)和丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)基因m RNA实时定量PCR结果显示:与C组比较,其m RNA水平在TP、DM、H组肾脏中均有上调,而H组上调最为明显,与ADRA1A、CACNA1E的表达趋势一致。5、WB检测:ADRA1A、CACNA1E、CCKAR和TLR-4、MAPK1基因的蛋白表达水平与m RNA实时定量PCR结果相符,以H组的表达水平最高。6、免疫组化结果显示:与C组正常兔相比,ADRA1A、CACNA1E、CCKAR、TLR-4和MAPK1基因在TP组、DM组、H组中的阳性细胞增多;H组中阳性细胞最多,其次为DM组;TP组则只有少量的表达,C组阳性细胞表达量最少。结论:1.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的炎症反应和肾脏钙化更严重。2.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的肾脏钙化加重可能与ADRA1A和CACNA1E受体表达上调介导钙内流增加有关;可能与CCKAR基因的表达上调无关。3.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的肾脏钙化加重可能与TLR-4受体和MAPK1基因表达上调介导的炎症反应增加有关。
【图文】：

肾组织,HE染色,兔肾,梅毒

3.1 实验动物构模成功我们课题组前期实验成功构建了糖尿病兔、梅毒兔和糖尿病合并梅毒兔[28]。3.2 HE 染色显微镜观察各组实验兔肾组织发现，正常组兔肾组织没有明显的病理改变。与正常组相比，梅毒组兔肾组织的肾小球毛细血管轻度扩张和肾近曲小管轻度肿胀，肾髓质区嗜酸粒细胞浸润。糖尿病组兔肾组织内除了有肾小球毛细血管轻度扩张和肾近曲小管轻度肿胀的病理改变外，髓质区、集合管区可见蛋白管型、上皮管型和间质粘液样变（见图 3.2.1）；糖尿病合并梅毒组兔肾组织除以上病理改变更加严重外，还有肾间质局灶性淋巴细胞和少量嗜酸性粒细胞浸润、近曲小管上皮水样变，，并且肾组织皮质区和髓质区的肾小管可见明显的钙盐沉积（见图图 3.2.2）。第 3 章实验结果

肾组织,HE染色,梅毒,糖尿病

DM 组 H 组图 3.2.2 各组实验兔肾组织 HE 染色结果图（×400）3.3 基因芯片基因芯片结果发现各实验组兔肾脏中的 ADRA1A、CACNA1E 和 CCKAR基因差异显著。糖尿病合并梅毒组（H 组）中 ADRA1A、CACNA1E 和 CCKAR基因的表达是正常组（C 组）的 3.6 倍，糖尿病合并梅毒组中 ADRA1A、CACNA1E和CCKAR基因的表达是梅毒组（TP组）的3.2倍，糖尿病组（DM组）中ADRA1A、CACNA1E 和 CCKAR 基因的表达是正常组的 1.4 倍。3.4 实时荧光定量 PCR（1）各实验分组兔肾脏中 ADRA1A 的 mRNA 表达量
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1;R759.1

【参考文献】