恒河猴Tetherin基因cSNP及HIV-1适应性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究

发布时间：2017-03-22 07:07

  本文关键词：恒河猴Tetherin基因cSNP及HIV-1适应性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：自然界中,病毒与宿主间存在协同进化的现象。一方面,宿主不断进化出防御机制来抑制病毒入侵、复制等,另一方面,病毒针对宿主的防御机制也进化出独特的机能来规避宿主对它的抑制。协同进化不仅促进了两个相互作用物种之间的适应性,增加了生物的多样性,同时也对病毒跨物种传播带来了很大阻碍。在人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的研究中发现,宿主细胞天然存在先天免疫因子,对病毒的侵入、复制和出芽存在限制作用。这些因子被称为“宿主限制因子”,参与先天性免疫反应,干扰病毒生命周期的不同阶段,达到对病毒的限制作用。目前已发现的限制因子有：APOBEC3G(apolipoprotein B mRNAediting enzyme 3G)、Trim5a (tripartite motif protein 5a)、Tetherin(也被称做CD317或HM1.24)、SAMHD1 (sterile a motif domain and HD domain-containing protein 1) [4,5]。这些限制因子可有效地限制逆转录病毒的感染,是宿主抵抗病毒感染的一个重要防御屏障。Tetherin是一种具有特殊拓扑结构的脂筏相关跨膜蛋白,它可通过连接病毒和宿主细胞膜,将新出芽的病毒束缚在细胞膜表面,从而限制病毒释放。在恒河猴免疫缺陷病毒(SIV)／恒河猴实验动物模型的研究中,人们同样发现了恒河猴细胞内也存在Tetherin蛋白来抑制SIV在恒河猴体内的扩散。而且恒河猴的Tetherin基因具有一定多态性,但是对于恒河猴Tetherin基因多态性及其多态性对自身蛋白结构和功能的影响并没有明确报道。另一方面,Tetherin作为一种天然抗病毒蛋白,在不同的物种中,它的蛋白结构也有所不同,具有物种特异性[2]。如果能使HIV跨过恒河猴Tetherin蛋白的限制作用,这可以成为对AIDS动物模型优化的重要一步。方法：本研究通过基因测序、序列比对、蛋白质结构预测等技术,探寻恒河猴tetherin基因位置上可能影响其蛋白功能的cSNP位点,再把不同基因型的tetherin插入到真核表达载体pcDNA3.1(.)中,构建不同基因型的tetherin表达载体。用不同基因型的tetherin表达载体与SIVmac239共转染293T细胞,检测转染后SIV的病毒载量,以及流式检测Tetherin基因在细胞表面的表达情况,最后对恒河猴进行基因型的分类,比较不同基因型SIV感染恒河猴之间的病毒复制情况。另一方面,构建表达恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL细胞系,通过HIV-1NL4-3在表达恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL与不表达恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL的混合细胞中培养,在体外模拟自然进化,最终使得HIV-1NL4-3能够产生适应性毒株,感染表达恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL,实现HIV-1NL4-3对恒河猴Tetherin限制作用的跨越。结果：序列比对发现8个非同义突变位点;用Psipred软件预测分析,发现其中G41A、T128C、C129和A333C这四个cSNP位点会使Tetherin蛋白的二级结构发生变化。在各基因型恒河猴tetherin表达载体与SIVmac239共转染293T的试验中发现,转染不同tetherin表达载体的293T细胞表达SIV病毒的载量之间并无统计学差异。但是不同基因型恒河猴的tetherin基因转染细胞后Tetherin蛋白表达有所不同,GLQ和GPH型的恒河猴Tetherin蛋白表达要显著高于DLQ和DPH型。在对不同基因型恒河猴的SIVmac239后病毒复制峰值和病毒复制控制值的比较中,发现DLQ基因型恒河猴病毒复制水平要高于GLQ型恒河猴(p0.05),其他基因型恒河猴的感染值之间没有显著差异。成功构建表达恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL后,通过HIVNL4-3分别在表达恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中和不表达恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中培养发现,比较两种细胞感染之间的病毒蛋白P24浓度以及活力,发现不同组别之间病毒P24浓度没有统计学差异。结论：在中国恒河猴的tetherin基因中,我们发现了9个cSNP位点,其中有四个cSNP位点(G41A、T128C、C129和A333C)可影响Tetherin蛋白的二级结构。经过体外细胞实验和恒河猴体内实验发现,恒河猴Tetherin基因的cSNP并没有影响其抗病毒作用,但却可以影响SIV对其拮抗作用。在HIVNL4-3对表达恒河猴Tetherin的TZM-BL的适应性培养中,我们并没有发现恒河猴Tetherin蛋白对HIVNL4-3的抑制作用,但这并不能说明恒河猴Tetherin蛋白对HIVNL4-3没有抑制作用,虽然Tetherin蛋白可以把病毒束缚在宿主细胞表面,但我们不能排除病毒通过细胞与细胞之间的接触反而使得病毒更容易发生扩散。
【关键词】：恒河猴 Tetherin cSNP SIV HIV
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.91
【目录】：

• 英文缩写词4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 第一部分 恒河猴猴tetherin基因编码区单核苷酸多态性及其对蛋白功能的影响12-38
• 第一节 引言12-13
• 第二节 实验材料13-17
• 第三节 实验方法17-30
• 第四节 实验结果30-36
• 第五节 讨论36-38
• 第二部分 HIV-1适应性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究38-56
• 第一节 引言38-39
• 第二节 实验材料39-43
• 第三节 实验方法43-52
• 第四节 实验结果52-55
• 第五节 讨论55-56
• 参考文献56-59
• 综述59-67
• 参考文献64-67
• 致谢67-68
• 个人基本情况68-69
• 硕士期间论文发表情况69-70

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 曾中兴;陈乾生;;提高恒河猴驯养成活率的经验[J];上海畜牧兽医通讯;1983年01期

2 朱智勇;翁景清;付桂明;姚顺荣;;流行性出血热病毒感染恒河猴的动态观察[J];中国公共卫生;1987年01期

3 杨森富,李绍东,杜金有,段幸生;恒河猴的繁殖研究[J];中国实验动物学杂志;1991年02期

4 张永蓉,秦川,张呈生,林杰,刘增华,刘亚莉;34例恒河猴尸检病理分析[J];中国实验动物学杂志;1993年Z2期

5 郑春福，蔡武卫，林宜平，李志雄;福建恒河猴定时交配法繁殖初探[J];北京实验动物科学与管理;1994年02期

6 彭传贵，孙岩松，李砚忠，江其辉，达文亮;北京地区恒河猴的人工饲养与繁殖[J];北京实验动物科学与管理;1994年04期

7 尤阳;;“恒河猴”的研究趣闻[J];父母必读;1980年03期

8 鱼婴;齐明;;恒河猴,在警告[J];父母必读;1988年03期

9 文军,沈文律,夏仁品,万云乐;恒河猴异种自然抗体滴度的测定[J];汕头大学医学院学报;2000年03期

10 程树军,黄韧,秦瑶,谭文雅;实验恒河猴肺自发病变的组织学观察[J];中国比较医学杂志;2003年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王冬平;随丽华;洪宝庆;孙岩松;李慕;李桂军;凡秀;;恒河猴与食蟹猴血液生理和生化指标的比较[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年

2 魏强;王健伟;张扬清;鲍琳琳;涂新明;蒋虹;高红;丛U，

本文编号：261080