联合多种细胞因子体外扩增外周血干细胞采集物来源的CMV特异性T细胞

发布时间：2020-04-24 05:57

【摘要】：目的建立巨细胞病毒特异性T淋巴细胞(cytomegalovirus specific T cells,CMV CTL)体外扩增的方法,通过实验证明经G-CSF动员的供者外周血干细胞采集物来源的CMV CTL具有抗巨细胞病毒作用,为临床开展过继免疫疗法治疗巨细胞病毒感染提供新的依据。方法用1μg/mL全长巨细胞病毒PP65(CMV pp65)多肽体外多轮刺激由粒细胞-集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)动员的外周血干细胞采集物中分离的单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),同时加入白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、IL-15、IL-21扩增20天。在培养第7天,加入丝裂霉素处理的负载CMV pp65抗原肽的自体PBMC,第10天补充经γ射线辐照处理并负载CMV pp65抗原肽的PBMC和CD3(OKT3);对照组为未加入抗原肽进行扩增的PBMC组。采用多色流式细胞术分别对扩增前、扩增后的T淋巴细胞表型及细胞内肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)的分泌水平进行分析,同时检测CD107a脱颗粒杀伤功能,并通过ELISA检测供者血清中CMV IgM/IgG抗体滴度水平。结果培养后可以收集得到(165.26±6.14)×10~6个细胞,其中CD3~+T细胞占89.21%,CD8~+T细胞占CD3~+T细胞的(43.54±28.03)%,CD4~+T细胞占CD3~+T细胞(34.23±26.18)%。获得的CD3~+T细胞以效应记忆性T细胞(effector memory T cells,T_(EM))为主,且扩增培养后的CD8~+和CD4~+T_(EM)比例较培养前显著增高。另外,培养后干细胞样记忆性T细胞(stem cell-like memory T cells,T_(SCM))和组织原位记忆T细胞(tissue-resident memory T cells,T_(RM))的比例均较培养前显著增加。在功能实验中,培养后得到的IFN-γ~+分泌型CMV特异性CD8~+T细胞群比例较扩增前明显增加,TNF-α~+CMV特异性CD8~+T细胞比例呈增长趋势;能够分别分泌IFN-γ和TNF-α的CMV特异性CD4~+T细胞群比例与培养前无明显变化。培养后CD8~+CMV特异性T细胞的CD107a表达水平为(3.28±1.97)%,与培养前无显著统计学差异。此外,供者体内CMV IgG水平与供者年龄呈现正相关,且在该培养体系下,IFN-γ~+和TNF-α~+CMV特异性T细胞扩增比例与供者年龄呈负相关。结论本研究成功建立了在体外有效扩增CMV CTL的方法,同时证明了由G-CSF动员的供者外周血干细胞采集物扩增得到的CMV CTL具有抗巨细胞病毒作用。
【图文】：

图 1 细胞形态学变化Figure 1 Morphological changes of CMV T cells 1st day of cultivation; B. The 6th day of cultivation; C. The 10th day of cultiThe 15th day of cultivation.

16图 2 体外扩增 T 细胞倍数变化Figure 2 Fold expansion of T cells in vitroA. Fold expansion of T cells in CMV pp65 antigen peptide added culture group; B. Fold
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R511

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本文编号：2638606