线粒体缺陷对白念珠菌感染小鼠肠道及肠道菌群微生态的影响研究

发布时间：2020-05-03 14:36

【摘要】：目的:研究白念珠菌线粒体缺陷株感染小鼠肠道的毒力和免疫差异及对肠道正常菌群微生态的影响。方法:小鼠随机分成5组(每组10只):A组、B组、C组、D组及E组。灌胃前统一喂养抗生素(四环素、链霉素、庆大霉素)溶液3天,A组给予白念珠菌标准菌株5314菌悬液灌胃,B组予等量白念珠菌缺陷菌株goa31菌悬液灌胃,C组予缺陷菌株nuo1菌悬液灌胃、D组予缺陷菌株nuo2菌悬液灌胃、E组予缺陷菌株ndh51菌悬液灌胃,构建小鼠肠道白念珠菌感染模型。灌胃期间持续予抗生素水喂养,灌胃后第1天、3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天后分别取粪便进行涂板计数。在灌胃后第1天,第3天,第7天,第15天颈椎脱臼处死小鼠,留取结肠组织,通过组织病理切片及实时荧光定量PCR比较各组肠道的组织病理学改变和炎症。肠道微生态实验分组及灌胃同上,喂养无菌水,灌胃后第1天及每隔两天收集小鼠粪便,提取RNA做16srRNA基因高通量测序,检测白念珠菌标准株及线粒体缺陷株对肠道菌群微生态的影响。结果:(1)粪便菌落计数:A组(5314)D组(nuo2)C组(nuo1)B组(goa31)E组(ndh51),野生株峰值与四组缺陷株菌落计数峰值出现在第6天,与野生菌株组峰值相差10^2以上(P0.05),菌落计数随着时间增加而逐渐减少,其中B组与E组第9天后粪便培养未见白念珠菌生长。(2)实时荧光定量PCR:和空白组(NC组)对比,A组小鼠肠粘膜炎症因子如IL-17、IFN-y、IL-22和TNF在白念珠菌5314感染一周后都出现显著性增加(P0.05),而在B、C、D、E四组缺陷菌中没有显著性变化。(3)组织病理:HE染色显示,A组小鼠肠粘膜淋巴细胞浸润显著性增多、肠绒毛破坏,而其余四组缺陷菌株小鼠肠粘膜基本没有炎症细胞浸润。PAS染色显示,A组小鼠肠道粘膜层可见较多假菌丝、孢子,部分菌丝嵌入肠道上皮细胞内;而其余四组缺陷菌小鼠肠道粘膜未见假菌丝及孢子。(4)肠道微生态结果:小鼠结肠微生物丰度最大的菌群是拟杆菌门、厚壁菌门,与灌胃前对比,灌胃后第三天Shannon指数和Simpson指数增加明显,有4个类菌群相对丰度在D3组小鼠结肠微生物菌群中显著增加,分别是Alistipesspp.,Bacteroides_acidifaciens spp,Bacteroidaceae spp,Bacteroides spp.结论:1.本实验我们初步证实,与野生株相比,四种缺陷株感染肠道能力明显下降,且表现为nuo2nuo1ndh51goa31,提示在感染肠道过程中,白念珠菌四种缺陷株由于线粒体功能缺陷引起的菌丝形成能力、毒力及代谢的变化,从而导致感染小鼠肠道的能力明显下降,且菌丝形成相对菌株结构或代谢变化对菌株毒力及肠道免疫的影响更大。2.灌胃白念珠菌后,肠道菌群丰度升高,但引起肠道微生态的改变是暂时的,肠道菌群微生态平衡在灌胃结束两周后恢复正常,且起重要作用的菌群可能是拟杆菌。
【图文】：

■■逡逑图２－１涂板菌落生长图逡逑图２－１邋Ｆ：灌胃前；Ａ：Ａ组（灌胃白念５３１４）小鼠粪便培养平板；Ｃ：邋Ｂ组（灌胃白念ｇｏａ３１）小鼠粪便培养逡逑平板：Ｄ：Ｃ组（灌胃白念ｍｉ0ｌ＞小鼠粪便培养平板：Ｅ：邋Ｄ组（灌胃白念ｎｕ0２）小鼠粪便培养平板：Ｆ：邋Ｅ组（灌逡逑胃白念ｎｄｈ５１）小鼠粪便培养平板。逡逑２．６．２四种缺陷株与野生株粪便菌落计数差异逡逑裴便菌落计数示：Ａ邋组（５３１４）邋＞０组邋Ｃｎｕｏ２）邋＞（３组（ｎｕｏｌ）邋＞８组邋Ｃｇｏａ３１）邋＞Ｅ逡逑组（ｎｄｈ５１），，菌落计数用均值＋方差表示，野生株与四组缺陷株峰值出现在第６天，逡逑缺陷株与野生菌株组峰值相差１０Ａ２以上（Ｐ＜０．０５），菌落计数随着时间增加而逐渐减逡逑少，其中Ｂ组与Ｅ组第９天后粪便培养未见白念珠菌生长，详见表格２－１。逡逑１４逡逑

图２－２不同组别小鼠粪便菌量计数与时间变化折线图逡逑２．６．３实时荧光定量ＰＣＲ检测小鼠肠道粘膜炎症因子变化情况逡逑五组小鼠肠粘膜炎症因子在转录水平的变化如图２－３所示。和空白组（ＮＣ组）对逡逑比，Ａ组小鼠肠粘膜炎症因子如ＩＬ－１７（Ａ）、ＩＦＮ－Ｙ（Ｂ）、ＩＬ－２２邋（Ｃ）和ＴＮＦ邋（Ｄ）在逡逑白念珠菌５３１４感染一周后都出现显著性增加（Ｐ＜０．０５），而在Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ四组缺陷逡逑菌中没有显著性变化，表明白念珠菌５３１４感染一周后引起了小鼠肠粘膜炎症反应，逡逑但灌胃四种缺陷菌株一周对小鼠肠粘膜免疫反应无明显影响。逡逑１５逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519.3

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本文编号：2647672