慢性乙型肝炎患者巨噬细胞外泌体抑制HBV复制及相关机制的研究

发布时间：2020-05-13 21:26

【摘要】：目的:探讨巨噬细胞外泌体对HBV复制的可能机制及与慢性乙型肝炎患者HBV DNA的相关性分析。方法:(1)体外诱导、鉴定单核巨噬细胞及其分泌的外泌体,并将单核巨噬细胞外泌体与HepG2.2.15细胞共培养,利用实时定量PCR检测共培养后细胞上清中HBV DNA的变化情况;(2)分析检测单核巨噬细胞外泌体中功能性微小RNA(microRNA,miRNA)的表达变化;(3)分别利用miRNA模拟物转染和阻断试验,验证筛选功能性miRNAs对HBV DNA抑制效应;(4)结合临床研究队列,分别入组慢乙肝免疫活化期(immune activation,IA)、低复制期(inactive carrier,IC)患者,同时健康供者(healthy control,HC)作为对照组,检测上述患者血清外泌体中功能性miRNAs分子的表达情况,并与慢性乙肝患者HBV复制水平做相关性分析,确定血清外泌体中功能性miRNAs分子变化的临床意义;(5)利用体外研究,验证不同免疫状态下患者外周血CD14阳性巨噬细胞及血清外泌体对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响。结果:(1)巨噬细胞外泌体抑制HBV复制;(2)巨噬细胞外泌体中miRNA-4284和miRNA-1260a的表达水平明显升高;(3)miRNA-4284和miRNA-1260a可以抑制HBV复制;(4)IC期患者血清外泌体中miRNA-4284和miRNA-1260a的表达均较IA期高;(5)IA期患者血清外泌体中miRNA-4284和miRNA-1260a的表达与患者HBV DNA载量呈负相关;(6)IC期患者血清及巨噬细胞外泌体对HBV抑制效果均明显强于IA期患者。结论:(1)体外,巨噬细胞外泌体抑制HBV复制可能是通过miRNA-4284和miRNA-1260a这两个效应分子发挥作用;(2)IC期患者血清外泌体中miRNA-4284和miRNA-1260a的表达较IA期高;(3)IC期患者血清外泌体及巨噬细胞外泌体抑制HBV DNA效果明显强于IA期患者。
【图文】：

单核巨噬细胞,流式,表面标志,阳性率

将贴壁的单核巨噬细胞用胰酶消化后通过流式染色如图1B 所示，高表达巨噬细胞 CD11b-FITC 和 CD14-percp-cy5.5 表面标志物，其阳性率分别为 82.8%、66.4%；同时高表达 M1 型单核巨噬细胞表面标志物 CD282-PE，阳性率为 94.6%；但是，低表达 M2 型单核巨噬细胞表面标志物 CD163-PE，阳性率为 0.19%。由此可见，经 PMA 诱导 24h 后，属于 M1 型单核巨噬细胞。（诱导出的单核巨噬细胞备用）图 1 单核巨噬细胞形态和流式鉴定A.THP-1 细胞经 PMA 诱导前、后形态学观察; B. THP-1 细胞诱导为单核巨噬细胞的流式学鉴定2.体外

单核巨噬细胞,表面标志,来源,流式

细胞术检测外泌体的表面标志：将提取出的单核巨噬细胞来源外泌式细胞术方法检测外泌体的特征性表面标志物 CD9-percp-v81-percp-vio700 的表达，如图 2B 所示，提取出外泌体 9-percp-vio700 和 CD81-percp-vio700,其阳性率分别为 42.2%和 40.7，，我们提取出的沉淀表达外泌体特有的表面标志物 CD9 和 CD81。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62

【参考文献】