重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞及其在烟曲霉感染中的作用

发布时间：2017-03-26 15:00

  本文关键词：重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞及其在烟曲霉感染中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着免疫抑制人群的增加,侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)的发病率呈上升趋势。近年来,宿主天然免疫在抗真菌感染中的作用和机制受到了广泛重视。模式识别作用是抗真菌天然免疫的始动环节,而模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)是天然免疫应答的始动点。通过调节PRRs的表达,干预宿主天然免疫状态,成为曲霉防治的突破点。树突状细胞相关C型凝集素-1 (dendritic cell-associated C-type lectin-1, Dectin-1)是重要的PRRs,通过识别真菌细胞壁的β-1,3葡聚糖,在抗真菌免疫过程中发挥重要作用。既往研究表明,巨噬细胞培养基中添加Dectin-1胞外区蛋白能显著增强其杀灭曲霉的能力。小鼠体内试验也提示,经尾静脉注射表达Dectin-1胞外区蛋白的重组腺病毒能提高小鼠烟曲霉感染生存率。肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AMs)是下呼吸道抵御病原微生物入侵的第一道防线,通过受体介导的内吞和非特异性吞噬作用清除曲霉孢子,释放多种细胞因子,募集并激活中性粒细胞、单核细胞等其它免疫细胞至感染部位,并能调节促炎因子和抗炎因子的平衡,协同抗曲霉炎症反应。本研究拟构建表达Dectin-1基因的重组腺病毒(Adenovirus, Ad),并使其携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)标记,通过转染AMs,建立Dectin-1高表达的细胞模型,观察烟曲霉感染过程中,Dectin-1高表达对AMs天然免疫防御功能的调节作用。第一部分重组腺病毒Ad-Dectin-1的构建及鉴定目的：构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒Ad-Dectinn-1,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。材料与方法：构建Dectin-1-pIRES2-EGFP重组质粒,以该质粒为模板PCR扩增目的片段,将目的片段重组到中间载体pDONR221上,再与腺病毒骨架质粒pAD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒pAD-Dectin-1-pIRES2-EGFP,经Pac Ⅰ线性化后转染人胚肾293 (human embryo kidney, HEK293)细胞,收获重组腺病毒Ad-Dectin-1,利用HEK293细胞大量扩增腺病毒,浓缩和纯化收获高浓度腺病毒。Real-time PCR法检测Dectin-1基因mRNA表达量,半数组织细胞感染(tissue culture infective dose, TCID50)法测定腺病毒滴度。结果：经酶切和菌落PCR鉴定证实重组腺病毒含有目的基因Dectin-1, Real-timePCR检测到Dectin-1表达量是空病毒对照组的8677倍,TCID50法测得浓缩和纯化后的重组腺病毒滴度为5×1011IU/ml。结论：成功构建了表达目的基因Dectin-1的重组腺病毒Ad-Dectin-1,并获得了较高的腺病毒滴度。第二部分重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞目的：重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,构建Dectin-1高表达的细胞模型。材料与方法：重组腺病毒Ad-Dectin-1体外转染MH-S细胞(Ad-Dectin-1-EGFP组),荧光显微镜观察转染情况,MTT法检测细胞增殖情况,确定转染的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)值。Real-time PCR法检测Dectin-1基因mRNA表达量,Western blot检测Dectin-1蛋白表达量,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞膜表面Dectin-1表达情况。同时设不转染腺病毒的MH-S细胞为空白对照,转染空病毒的MH-S细胞为阴性对照(Ad-EGFP组)。结果：重组腺病毒转染MH-S细胞12h即可见少量绿色荧光表达,48 h荧光强度达到峰值,MOI值为2200时细胞增值率下降,转染最佳MOI值为1800。Real-timePCR和Western blot检测发现,Dectin-1基因mRNA和蛋白表达量均较Ad-EGFP组显著增加。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测进一步证实,细胞膜表面有Dectin-1表达,且表达量较Ad-EGFP组显著增加。结论：重组腺病毒Ad-Dectin-1可在体外转染MH-S细胞,转染后Dectin-1基因mRNA和蛋白表达显著增加,Dectin-1高表达的细胞模型构建成功。第三部分Dectin-1高表达的小鼠肺泡巨噬细胞在烟曲霉感染中的作用目的：探讨Dectin-1高表达对小鼠肺泡巨噬细胞抗烟曲霉感染能力的影响。材料与方法：通过转染重组腺病毒Ad-Dectin-1构建Dectin-1高表达的MH-S细胞模型,用烟曲霉孢子感染,Real-time PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10mRNA的表达量,ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α和IL-10的量,平板菌落计数法计算MH-S细胞对烟曲霉孢子的杀灭百分数。结果：Real-time PCR和ELISA法检测结果表明,Dectin-1高表达的MH-S细胞在受到烟曲霉孢子刺激时,炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10的表达量增加。平板菌落计数法结果显示,Dectin-1高表达的MH-S细胞对孢子的杀灭百分数显著高于对照组。结论：在烟曲霉感染过程中,Decetin-1高表达的MH-S细胞炎症因子表达量增加,对烟曲霉孢子的杀灭能力增强,提示Dectin-1高表达可能通过调节天然免疫反应提高宿主抵抗曲霉感染的能力。
【关键词】：重组腺病毒 Dectin-1 肺泡巨噬细胞 烟曲霉 天然免疫 细胞因子
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R519.8
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-18
• 参考文献15-18
• 第一部分 重组腺病毒Ad-Dectin-1的构建及鉴定18-34
• 引言18
• 材料与方法18-25
• 结果25-30
• 讨论30-31
• 小结31-32
• 参考文献32-34
• 第二部分 重组腺病毒Ad-Dectin-1转染小鼠肺泡巨噬细胞34-46
• 引言34
• 材料与方法34-39
• 结果39-43
• 讨论43
• 小结43-44
• 参考文献44-46
• 第三部分 Dectin-1高表达的小鼠肺泡巨噬细胞在烟曲霉感染中的作用46-58
• 引言46
• 材料与方法46-50
• 结果50-54
• 讨论54-55
• 小结55-56
• 参考文献56-58
• 全文总结58-59
• 文献综述59-65
• 参考文献62-65
• 硕士期间发表论文65-66
• 致谢66-67

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