HBV感染诱导肝窦内皮细胞活化并促进CTL应答的功能及机制研究

发布时间：2020-05-31 11:14

【摘要】：目的:肝窦内皮细胞(LSECs)通过诱导抗原特异性T细胞耐受,在维持肝内微环境稳态方面发挥重要作用。然而,某些病毒感染或TLRs刺激可诱导LSECs功能成熟并逆转其抑制属性从而诱导T细胞免疫。到目前为止,人们对于HBV感染过程中LSECs能否以及怎样调节T细胞免疫仍知之甚少。本研究旨在探讨HBV感染过程中肝窦内皮细胞调节CD8+T细胞免疫的功能及其机制。材料与方法:1.雄性6-8W龄C57BL/6小鼠,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。2.分别用急性HBV质粒p SM2、慢性HBV质粒p AAV/HBV1.2高压尾静脉注射构建HBV急、慢性复制小鼠模型。于特定时间点处死小鼠并分离肝窦内皮细胞、库普弗细胞、肝细胞,与多克隆活化T细胞共孵育,ELISA检测共孵育48h上清中IFNγ水平。3.体外用HBs Ag、HBe Ag、HBc Ag刺激野生型小鼠肝血窦抗原提呈细胞24h后,与多克隆活化T细胞共孵育,ELISA检测共孵育48h上清中IFNγ水平。4.实验组小鼠高压尾静脉注射HBe Ag短时表达质粒pc DNA3.1/HBe Ag,对照组小鼠高压尾静脉注射不表达HBe Ag对照质粒pc DNA3.1/null,2dpi后分离小鼠肝窦内皮细胞,与多克隆活化T细胞共孵育,ELISA检测共孵育48h上清中IFNγ水平。5.分别予以高压尾注射p BS/HBV1.3+p CI-neo/null、p BS/HBV1.3-HBe Ag(-)+p CI-neo/null、pBS/HBV1.3-HBe Ag(-)+pCI-neo/HBe Ag构建HBV正常复制、HBe Ag缺陷表达、HBe Ag补充三种HBe Ag不同水平体内表达模型,于特定时间点采血及处死小鼠,分离小鼠肝内浸润淋巴细胞、脾组织淋巴细胞、肝窦内皮细胞,ELISA检测小鼠血清中HBe Ag、HBs Ag,流式检测肝内浸润淋巴细胞、脾组织淋巴细胞T细胞活化表型(CD25、CD69、CD62L、PD1、CD44)以及T细胞功能(IFNγ、TNFα、IL-2);将各组小鼠肝窦内皮细胞与多克隆活化T细胞共孵育,ELISA检测共孵育48h上清中IFNγ水平。6.流式检测HBV肝内复制第14dpi以及HBe Ag体外刺激的肝窦内皮细胞共刺激分子(MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86、PD-L1)表达;流式CBA及ELISA检测HBV肝内复制14dpi以及HBe Ag体外刺激的肝窦内皮细胞培养24h上清中炎性细胞因子表达(TNFα、IL-6、IL-10、MCP1、IL-27)。7.在na?ve小鼠LSECs与多克隆活化T细胞共孵育体系中加入TNFα或IL-27重组蛋白,ELISA检测共孵育48h上清中IFNγ水平;在HBe Ag体外刺激的肝窦内皮细胞与多克隆活化T细胞共孵育体系中加入TNFα或(和)IL-27中和性抗体,ELISA检测共孵育48h上清中IFNγ水平。结果:1.与对照组相比,HBV急性、慢性肝内复制第14dpi可诱导肝窦内皮细胞逆转其耐受属性并促进T细胞免疫,且HBV急性肝内复制组肝窦内皮细胞诱导T细胞产生IFNγ的水平高于HBV慢性肝内复制组及对照组。HBV肝内复制对库普弗细胞和肝细胞功能影响并不大。2.HBV蛋白组分(HBe Ag、HBs Ag)体外刺激可诱导肝窦内皮细胞功能成熟并促进T细胞免疫;HBV蛋白组分(HBe Ag、HBs Ag)体外刺激增强库普弗的抑制属性并诱导T细胞耐受。3.HBe Ag体内、体外刺激均能诱导肝窦内皮细胞功能成熟并促进T细胞免疫。4.与HBV正常复制组相比,HBe Ag缺陷表达组T细胞功能减弱;HBe Ag体内补充能更好的促进肝窦内皮细胞功能活化、修复T细胞功能并加速病毒清除。5.HBV急、慢性肝内复制对肝窦内皮细胞共刺激分子的表达无明显影响;与HBV慢性肝内复制组及对照组相比,HBV急性肝内复制诱导肝窦内皮细胞能产生更高水平的TNFα、IL-27、IL-10。6.HBe Ag体外刺激诱导肝窦内皮细胞产生TNFα、IL-27、IL-10、MCP1高于对照组;HBe Ag体外刺激促进肝窦内皮细胞上调MHCⅠ类分子、下调PD-L1。7.在LSECs与T细胞共孵育体系中补充TNFα或IL-27可解除LSECs对T细胞的抑制作用;TNFα或IL-27体外阻断可部分消除HBe Ag刺激的LSECs促进T细胞产生IFN-γ的能力。结论:HBV肝内复制可逆转LSECs的抑制特性并促进T细胞免疫,这可能部分是由HBe Ag诱导LSECs产生TNFα和IL-27所介导。HBV诱导LSECs免疫功能成熟的机制仍需进一步研究。本研究的创新点(1)首次在HBV高压水注射模型中发现HBV感染能诱导肝血窦固有抗原提呈细胞LSECs功能活化,而对其他肝血窦抗原提呈细胞如KCs、肝细胞影响并不大,为靶向增强肝内免疫提供了重要线索。(2)首次发现HBe Ag能诱导LSECs和KC发生免疫功能差异分化,将对寻找慢性乙型肝炎免疫治疗的新策略提供重要线索和理论依据。(3)首次对HBV感染过程中肝窦内皮细胞功能活化的具体分子机制加以阐述,理论创新性强,研究成果将为阐明HBV感染慢性化的肝内机制提供新思路。
【图文】：

小鼠血清,HBV复制

HBV 表面抗原(HBsAg)，e 抗原(HBeAg)清除情况，如图 1 所示：急性和慢性 HBV 复制小鼠血清中 HBsAg 和 HBeAg 均于高压尾静脉注射后第 1 天(1dpi)呈现一个高水平表达；急性 HBV 复制小鼠表面抗原的表达于 4dpi 后开始迅速下降，于 14dpi 检测不到，其 e 抗原的表达于 1dpi 后开始迅速下降，于 21dpi 检测不到；而慢性 HBV 复制小鼠血清中表面抗原于 7dpi 上升至最高水平，随后开始下降，至观察结束(25dpi)仍维持在一个比较高的水平(OD 值平均约为 1)，而其 e 抗原的水平也于 1dpi 开始下降，于 7-21dpi 均维持在一个比较低的水平，于 25dpi 检测不到。我们在实验中发现，慢性 HBV 复制组小鼠血清中 HBeAg 的表达水平(OD450 值)在第一天是明显低于急性组的，虽然慢性 HBV 复制模型中 HBeAg 下降早于且快于急性模型，但于 21dpi，急性组所有小鼠 HBeAg 完全检测不到，但慢性组部分小鼠 HBeAg仍为阳性，虽然表现为低水平表达，这体现了急、慢性 HBV 复制模型中 HBeAg 清除速度的不同。这可能与 HBV 高压尾静脉模型的不稳定性有关。

细胞免疫,肝窦内皮细胞,HBV复制,活化T细胞

华中科技大学博士学位论文肝窦内皮细胞可功能成熟并诱导 T 细胞免疫，同时也显示出急性和慢性 HBV 复制小鼠肝窦内皮细胞在调控 T 细胞免疫方面存在差异。在 HBV 复制的晚期，如 21/28dpi，HBV 肝内复制并不能明显诱导肝窦内皮细胞功能成熟。在整个 HBV 肝内复制的过程中，，肝窦内皮细胞调控 T 细胞免疫的能力是动态变化的，可于 HBV 复制 14dpi 功能成熟并诱导 T 细胞免疫，如图 2-B 所示。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62

【参考文献】