【摘要】：背景:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染后能抑制人体的免疫应答,造成免疫耐受并导致HBV感染慢性化。抗病毒是治疗慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)最有效的手段,国际上各种指南以及我国的指南均推荐两大类抗病毒药物,即干扰素类和核苷(酸)类似物。与核苷(酸)类药物相比,干扰素类药物更能有效的使患者获得乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)的血清学转换,乙肝患者如能实现HBs Ag的血清学转换并长期维持,将可能彻底清除病毒并防止其再次入侵。然而,干扰素治疗后乙肝患者的免疫调节机制尚不完全清楚。作为乙肝病毒表面抗体(Hepatitis B virus surface antibody,HBs Ab)来源的B细胞在清除HBV的过程中起着至关重要的作用。B细胞活化和分化受到滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells,Tfh)的调控,而Tfh是定位于淋巴滤泡中的一类CD4和CXCR5双阳性的T淋巴细胞亚群,其主要转录因子为Bcl-6,膜表面高度表达ICOS、PD-1、CD40L等分子。Tfh细胞又可以根据其分泌的IFN-γ、IL-4、IL-17分为Tfh1、Tfh2、Tfh17三种不同的细胞亚群,研究表明这些细胞亚群在B细胞的分化、成熟以及免疫球蛋白类别转换过程中起着各自不同的信息传递作用。已有研究证实,Tfh细胞参与了HBV感染后的抗病毒免疫过程。迄今为止,尚没有干扰素治疗CHB患者的过程中,Tfh细胞频率、功能、生物学意义及其相关调控机制的研究。目的:研究长效干扰素聚乙二醇干扰素-α(Pegylated interferon alpha,PEG-IFN-α)治疗前后的CHB患者,Tfh细胞和B细胞在抗病毒免疫应答中的功能变化,探讨Tfh细胞调控B细胞产生保护性中和抗体的途径,以期提高乙肝抗原血清学转换的效率,为临床治愈乙肝提供理论基础和指导。方法:本研究纳入CHB患者59例,以及年龄、性别相匹配的健康对照者(Healthy controls,HC)15例。CHB患者接受标准48周PEG-IFN-α治疗,并随访至96周,根据治疗后患者的应答情况分为完全应答组(Complete Response Group,CRG),不完全应答组(Incomplete Response Group,ICRG),无应答组(Non-Response Group,NRG)。利用流式细胞技术检测CHB患者应用PEG-IFN-α治疗前和治疗后12、48、96周不同时相点以及对照组外周血中Tfh细胞表面标记物CD3/CD4/CXCR5/CD40L/ICOS/PD-1和B细胞表面标记物CD19/CD20/CD21/CD38/CD138的表达水平。流式分选获得健康人和患者外周血或扁桃体中的Tfh细胞、B细胞,并通过体外共培养体系验证治疗后不同应答反应患者Tfh细胞辅助B细胞分化及抗体分泌的功能差异,同时利用体外培养实验研究IFN-α或HBV对Tfh细胞功能性分子表达的影响。应用基因芯片技术分析患者外周血中Tfh细胞的基因表达谱、免疫荧光共聚焦实验用于检测CHB患者肝穿组织中的Tfh细胞表面标记物CD40L/ICOS的表达水平、流式微球阵列(CBA)实验用于检测细胞因子IFN-γ、TNF-a、IL-17A、IL-10、IL-6、IL-4和IL-2的浓度以及免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M的含量。结果:1.本研究59例纳入者中,有42例CHB患者完成了标准48周PEG-IFN-α的治疗,并随访至96周。根据治疗后的患者应答情况,CRG组为14例,ICRG组为8例,NRG组为20例。2.流式细胞技术发现,PEG-IFN-α治疗前,CHB患者外周血中CD38hiCD138~+浆细胞、Ig G~+CD21~+B细胞、CD4~+CXCR5~+Tfh细胞、ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞、CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞和PD-1hiCD4~+CXCR5~+Tfh细胞频率以及血清Ig G、Ig M水平均高于HC组,Tfh1细胞频率低于HC组,而Tfh2细胞和Tfh17细胞频率没有显著差异。动态分析PEG-IFN-α治疗前和治疗后12、48、96周不同时相点外周血中Tfh细胞和B细胞亚群的频率以及血清免疫球蛋白的变化,发现ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞、CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞、Tfh1细胞、CD38hiCD138~+浆细胞、Ig G~+CD21~+B细胞频率以及血清Ig G、Ig M水平在CRG组中随着治疗呈现时间依赖性的增加并在48周时达到高峰。而且PEG-IFN-α治疗48周后,CRG组患者外周血中ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞、CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞、Tfh1细胞、CD38hiCD138~+浆细胞、Ig G~+CD21~+B细胞频率以及血清Ig G、Ig M水平均高于NRG和ICRG组。3.经相关性分析,发现CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞的频率分别与HBs Ab浓度、CD38hiCD138~+浆细胞、Ig G~+CD21~+B细胞和血清Ig G水平正相关,而ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞与这些指标均没有相关性。4.免疫荧光共聚焦技术发现,CHB患者肝组织中CD40L~+CD4~+CXCR5~+和ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞频率升高,而且CXCR5~+CD40L~+和CXCR5~+ICOS~+Tfh-like细胞与B细胞在位置上紧邻。5.体外实验中,来自于不同应答组和健康对照组的Tfh细胞与来自于同一健康捐赠者的B细胞共培养,对比于NRG和HC组,CRG组Tfh细胞具有更强的促进B细胞分化为记忆B细胞以及产生抗体的能力。利用Transwell体系进行Hep G2.215细胞与外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)共培养发现,HBV抑制了Tfh细胞上CD40L的表达;共培养体系中添加重组人蛋白IFN-α会刺激Tfh细胞上CD40L和ICOS的高表达;当用anti-CD40抗体阻断CD40-CD40L途径比用anti-ICOS抗体阻断ICOS-ICOSL途径更能减少Ig G~+B细胞的产生。6.基因芯片技术分析不同应答组外周血Tfh细胞的基因表达谱,发现CRG组中Tfh细胞CD40L以及干扰素刺激因子基因的表达高于NRG和ICRG组,而ICOS并没有显著变化。结论:1.CHB患者外周血和肝内CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh、ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞的频率升高,且肝组织中Tfh-like细胞与B细胞位置上紧邻,表明Tfh细胞可能直接调节B细胞的活性,这与肝脏的损害可能有密切的联系,验证了Tfh细胞直接参与CHB的发病机制。2.循环Tfh1细胞频率在CHB患者中显著减少,经PEG-IFN-α治疗后在CRG组显著升高,表明Tfh1细胞可能参与了CHB的发病机制,且在HBV清除的过程中发挥重要作用。3.PEG-IFN-α治疗后,CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh和ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞频率在CRG组中升高,且Tfh细胞具有更强的能力促进B细胞分化以及抗体的产生,表明PEG-IFN-α治疗增强CRG组患者Tfh细胞辅助B细胞产生抗体的能力,从而促进HBs Ag的血清学转换。4.体外共培养实验发现HBV的存在抑制Tfh细胞上CD40L的表达,这可能是机体免疫耐受状态形成的原因之一,而IFN-α能够间接诱导Tfh细胞CD40L和ICOS的表达。5.发现并证明了CD40L~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞比ICOS~+CD4~+CXCR5~+Tfh细胞更能有效的激活B细胞,促进HBs Ab的产生,达到HBs Ag的血清学转换。寻找更有效的刺激CD40L的表达方法,进而有效的激活免疫耐受状态下的Tfh-B细胞轴,或可成为未来CHB的新型治疗手段。
【图文】：
图 2.1 乙肝病毒感染的持续性是由多个细胞之间复杂的相互作用决定的[19]Figure 2.1 The persistence of HBV infections is determined by the complexinteractions of multiple leukocytes.2.1.1 固有免疫系统
图 2.2 滤泡辅助性 T 细胞的分化和抑制是一个多阶段、多因子参与的过程[71]Figure 2.2 Follicular helper T cell differentiation and inhibition is multi-step,multifactorial2.2.3 Tfh 细胞的分子标记物
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R512.62
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本文编号：
2707247
