低频低强度超声联合载两性霉素B纳米粒对白念珠菌生物膜协同杀菌的实验研究

发布时间：2020-06-14 07:42

【摘要】：目的白念珠菌(C.albicans)是人类最常见的条件致病菌。其感染的特殊性和难治性在于白念珠菌易形成生物膜,生物膜使真菌耐药性大大增加,感染经久不愈。本实验预将抗真菌药物两性霉素B(Amphotericin B,AmB)包载入PLGA纳米粒内,联合低频低强度超声(Low-frequency and Low-intensity Ultrasound,LFLIU)辐照,探究超声联合载药纳米粒对白念珠菌生物膜的体内外协同抗菌作用,以期达到药物增效提高治疗效果,为临床真菌生物膜感染治疗提供一种新思路。方法1.载两性霉素B PLGA纳米粒(AmB-NPs)的制备及特性检测:采用双乳化法制备PLGA纳米粒,利用马尔文激光粒度仪检测纳米粒的粒径、电位及分散性,电镜下观察纳米粒表面及内部形态,测量载药纳米粒48h内药物自然释放率及一定超声辐照后药物的释放效率,并比较载药纳米粒AmB-NPs与游离药物AmB对正常细胞的毒性。2.超声联合载药纳米粒对白念珠菌浮游菌的杀菌作用:选择白念珠菌标准菌株ATCC10231培养至对数期,并进行药敏实验。实验选用固定频率为42 kHz,换能器直径约为1.0 cm,输出声强为0.15-0.60 W/cm~2连续可调的低频低强度超声设备。探究不同超声强度(0.15,0.30和0.60 W/cm~2)和不同辐照时间(5,15和30 min)对白念珠菌浮游菌的影响以筛选适合的超声剂量。然后联合不同浓度AmB载药纳米粒作用于白色念珠菌浮游菌,探究其对浮游菌活性及结构的影响。3.超声联合载药纳米粒对白念珠菌生物膜的体外杀菌作用:采用细胞培养板法建立体外生物膜模型,测定AmB及AmB-NPs对白念珠菌生物膜最小抑菌浓度(SMIC)。超声联合载药纳米粒对白念珠菌生物膜处理后,对生物膜的活性及生物膜总量进行测定,利用激光共聚焦显微镜对生物膜作定性和定量分析,并检测生物膜分泌的蛋白酶和磷脂酶活性进而对生物膜的毒性进行分析。4.超声联合载药纳米粒对白念珠菌生物膜的体内杀菌作用:将白念珠菌菌液浸泡过的聚氨酯导管植入SD大鼠背部皮下,建立白念珠菌生物膜大鼠皮下感染模型。在治疗前,进行低频低强度超声对大鼠经皮辐照的安全性验证,在超声联合载药纳米粒连续治疗3天和7天后,对导管表面的菌落进行测定,并通过激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)和扫描电镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)观察导管表面生物膜结构改变。结果1.载药纳米粒AmB-NPs特性:光镜下观察见两性霉素B纳米粒呈球形,分散性良好,粒径约为300nm,表面带负电荷,透射电镜下可见药物清晰包载纳米粒内部,并计算出AmB-NPs的载药率为5.7%,包封率为85%。在48h内连续监测药物释放率,结果显示超声能够明显促进药物的释放,48h后,其释放量约为自然释放的2倍,这为后续超声协同AmB-NPs提高治疗效果提高了有利条件。2.超声联合载药纳米粒对白念珠菌浮游菌的杀菌作用:在不同超声剂量作用后,根据白念珠菌活性的检测和透射电镜观察,当超声条件为0.30W/cm~2照射15分钟时,白色念珠菌的细胞壁屏障被有效破坏,细胞通透性增加,但白色念珠菌的活性并没有明显减低。因此,声强0.30W/cm~2、超声辐照时间15min为纳米颗粒进入细胞内的后续药物递送提供了最佳条件。平板培养菌落计数显示超声联合AmB-NPs处理后白念珠菌的存活率下降约(91±0.12)%,且STYO9/PI荧光染色后CLSM观察:在超声联合AmB-NP作用后,活细胞数(绿色荧光)明显减少,死细胞数(红色荧光)显著增加。3.超声联合载药纳米粒对白念珠菌生物膜的体外杀菌作用:经结晶紫染色后观察,白念珠菌在连续培养48h后形成主要由细胞外基质组成,具有一定厚度的紧密膜状结构,且XTT减低法定量检测生物膜的动态生长变化结果也显示在48-72h,生物膜的生长曲线变得平缓,吸光值趋于稳定,逐渐变达到成熟状态。经超声联合AmB-NPs作用于成熟白色念珠菌生物膜后,与对照组相比,生物膜活性及生物膜总量均显著降低,下降达74.64%和31.26%(P0.01)。同时,当超声联合AmB-NPs作用后,CLSM观察到生物膜结构稀疏,厚度变薄,死菌增多,生物膜基本以红色荧光(死菌)为主,仅基本无活性生物膜残留。此外,超声联合载药微球干预后可以明显降低蛋白酶、磷脂酶的活性。4.超声联合载药纳米粒对白念珠菌生物膜的体内杀菌作用:在导管植入皮下72h后导管上真菌的定植量趋于稳定,且用结晶紫染色观察及扫描电镜观察显示明显的生物膜结构附着于导管表面。不同剂量超声照射后大鼠皮肤组织的组织病理学结果显示,超声辐照的安全阈值为声强0.3W/cm~2辐照时间15分钟。经超声联合载药纳米粒治疗3天或7天后,超声联合AmB-NPs处理的大鼠的真菌负载量显著低于游离AmB处理的大鼠组或接受其他处理的大鼠组(P0.01),且连续7天治疗后效果更明显。同时CLSM和SEM观察显示经超声与AmB-NPs的联合作用之后,在导管表面上生物膜结构被破坏,细胞外基质变少或消失,仅留下单个真菌菌落,基本上消除了生物膜。结论本实验证实了低频低强度超声联合PLGA载两性霉素B纳米粒在体内外具有协同抗菌作用,能够显著提高对白念珠菌生物膜的抗菌效果,为临床治疗白念珠菌及生物膜感染提供一种新的思路。 【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519

【图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文声材料放置在水浴槽的底部以防止超声波反射。 超声辐照装置的示意图如图 1所示。在超声辐照之前，所有样品保持室温 22℃。 在超声辐照完成后，立即将XMZ 数字显示温度控制器的温度探头放置在溶液的中心，测量菌液的即时温度，并记录超声波照射前后的菌液实时温度。

Rosup 是试剂盒中提供的一种 ROS 阳性刺激物。通过流式细胞仪定量荧光轻度反应细胞中的 ROS 水平。1.2.11 统计学分析使用 SPSS20.0 软件对实验数据进行单因素方差分析，以均值±标准表示，并采用 GraphPad Prism 5.0 软件做图，以 P<0.05 表示差异有统计2 结果2.1 白色念珠菌生长曲线检测通过检测不同培养时间白色念珠菌菌液的 OD490值，绘制其生长曲图 2 所示。这条曲线显示了白色念珠菌生长过程中的迟缓期、对数期、衰亡期，，其中本实验所用白色念珠菌 ATCC10231 在该培养条件下对数为 16 h-24 h。

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本文编号：2712473