C型凝集素CLEC4M对负载HCV免疫分子的影响

发布时间：2017-03-28 07:16

  本文关键词：C型凝集素CLEC4M对负载HCV免疫分子的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是当今最受关注的世界性公共健康问题之一,同时是严重危害人类健康的常见病和多发病。根据流行病学调查和世界卫生组织统计,全世界超过1.7亿人感染HCV。初次感染HCV后,约有70%~80%的患者发展成慢性感染,甚至发展为肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌。中国是HCV感染大国,约有3000万人群感染,占全球感染总人数的1/5,居世界之首,严重危害我国人口健康。根据我国国情及HCV患者的基因型等,HCV感染者治疗方案仍以Peg-IFN-α联合RBV为主。自2012年起,慢性丙型肝炎被列为国家十二个重点疾病之一。肝脏是HCV感染人体的主要靶器官。HCV感染肝细胞是一个需要多种细胞表面受体分子复合物参与的复杂过程,具体机制尚未完全阐明。由于缺乏理想的动物模型,对HCV致病机制的研究存在许多困难。近年来HCV体外培养系统的建立及转基因小鼠动物模型的不断更新,促进了HCV的研究走向深入。HCV感染肝细胞,通过病毒包膜蛋白E1和E2与细胞表面受体CD81、B族I型清道夫受体(SR-BI)、紧密连接蛋白家族即CLDN-1和Occludin等分子的结合,逃逸机体的免疫监视。最新研究发现,C型凝集素CLEC4M(以下简称CLEC4M)可能是介导HCV入胞的重要分子。CLEC4M是一种外源C型植物血凝素的II型跨膜蛋白,基因定位于19p13.3,分子量为46k Da。CLEC4M专一地、大量地选择性表达于成熟与未成熟的肝窦内皮细胞、淋巴窦内皮细胞及胎盘毛细血管。天然配体ICAM-3主要表达于T细胞上,外源性抗原经加工提呈后可以被大量的T细胞受体(TCRs)识别。树突状细胞(dendritic cell,DC)是迄今为止所知的功能最强的抗原提呈细胞,刺激初始型T细胞活化和增殖是DC的标志性特征,在免疫反应中起着举足轻重的作用。DC与病毒感染是近年研究热点,其抗感染的功能主要是通过识别病原体结构分子,启动细胞内信号转导通路,激活特异性免疫反应,表现为细胞因子或趋化因子分泌水平的变化。然而DC是一把双刃剑,呈递抗原的同时又成为病毒的传播者,充当了“特洛伊木马”的作用。本课题前期实验研究发现,DC表面可以大量表达CLEC4M分子。因此,我们推测,CLEC4M可能参与HCV的入胞过程,逃逸宿主的免疫攻击,从而影响T细胞的免疫功能调控,而这可能是HCV慢性化的重要原因之一。为了进一步研究负载HCV后的CLEC4M对机体免疫应答水平的影响,本实验在国家自然科学基金(No:81170390)资助下进行了以下工作:1.慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞CLEC4M的检测及临床意义提取人外周血单个核细胞,流式细胞术检测HCV初治患者、早期病毒学应答组、持续病毒学应答组和健康对照组的CLEC4M/CD14的表达率,并分析各组之间的差异。采用Spearman相关检验分析慢性HCV患者CLEC4M/CD14的表达率与临床指标的相关性。2.构建稳定过表达CLEC4M的Huh7.5细胞系从CD14+细胞中克隆c CLEC4M基因,成功构建GV166-CLEC4M慢病毒表达载体,脂质体法转染293T细胞,利用获得的慢病毒液转染Huh7.5细胞,获得稳定过表达CLEC4M的Huh7.5细胞系,并利用Western Blot和RT-PCR检测CLEC4M的过表达情况。3.HCV体外培养系统的构建使用本室保存的包含HCV全长序列的质粒p FL-J6/JFH,经过酶切线性、DNA纯化及T7体外转录等步骤,获得全长HCV转录本。然后利用DMRIE-C转染试剂转染Huh-7.5细胞,收集HCVcc的病毒液并进行感染性检测。4.C型凝集素CLEC4M对HCVcc易感性的影响利用已经制备好的具有高感染效率的HCVcc病毒液感染稳定过表达CLEC4M的Huh7.5细胞系,并设置单克隆抗体干扰组、甘露聚糖感染组和空白对照组。采用免疫荧光检测和RT-PCR法检测CLEC4M对HCVcc感染效率的影响。5.树突状细胞的体外培养鉴定及CLEC4M分子的鉴定预先提取健康志愿者外周血PBMCs,利用CD14免疫磁珠分选技术分离CD14+单核细胞,利用rh GM-CSF和rh IL-4刺激PBMC向DC方向分化,培养第5d加入TNF-α,刺激DC细胞的成熟。利用流式细胞仪分别检测CD14+的分离效率,及CLEC4M在CD14+细胞的表达率。通过流式细胞仪检测DC的表面标志分子CD83和CD86的表达率,鉴定DC细胞的成熟,同时检测成熟DC细胞CLEC4M的表达。6.CLEC4M介导DC负载HCVcc后,免疫应答水平的变化应用CLEC4M单克隆阻断抗体阻断DC表面CLEC4M的表达后,再用提前制备好的HCVcc病毒液感染DC,设置甘露聚糖干扰组、空白对照组。分别收集感染各组的细胞上清液,采用ELISA法检测IL-12p70、IL-10的表达变化。结论:1.CLEC4M参与了HCV的感染过程。检测了慢性HCV感染者外周血PBMC中CLEC4M/CD14的表达率,HCV初治患者中CLEC4M/CD14明显高于健康对照组、EVR组和SVR组,健康对照组、EVR组及SVR组各组表达率无显著性差异,表明CLEC4M参与了HCV的感染过程并诱导了机体的免疫应答从而损伤了肝脏组织,加速疾病的进展。2.构建了稳定过表达CLEC4M的Huh7.5细胞。应用HCV细胞体外培养系统(HCVcc)感染过表达CLEC4M的Huh7.5细胞,提高了HCVcc的易感性,说明CLEC4M可能参与了HCV的入胞过程。3.诱导成熟DC的培养后,检测CLEC4M在其表面高表达,再用HCVcc感染DC细胞,并设置阻断实验组,检测IL-12p70、IL-10的表达。结果显示阳性对照组IL-12p70、IL-10的水平明显高于CLEC4M单抗干扰组和甘露聚糖干扰组,说明CLEC4M介导了HCV感染DC,从而影响免疫分子的水平。
【关键词】：丙型肝炎病毒 C型凝集素家族4M 外周血单个核细胞 分子受体 树突状细胞 HCV体外培养细胞模型
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-19
• 文献回顾19-30
• 第一部分 慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞CLEC4M的检测及临床意义2530-39
• 1 材料30-33
• 1.1 主要仪器与耗材30
• 1.2 主要实验试剂30-31
• 1.3 主要实验试剂配制31-32
• 1.4 研究对象32-33
• 2 方法33-35
• 2.1 密度梯度离心法分离人外周血PBMC33-34
• 2.2 流式细胞术检测CLEC4M的表达34
• 2.3 统计学分析34-35
• 3 结果35-37
• 3.1 CD14 及CLEC4M圈门35-36
• 3.2 慢性HCV感染者CLEC4M/CD14 的表达率36
• 3.3 CLEC4M/CD14 的表达率与临床指标的相关性分析36-37
• 4 讨论37-39
• 第二部分C型凝集素CLEC4M对HCVcc易感性的影响39-56
• 1 材料39-42
• 1.1 主要仪器与耗材39-40
• 1.2 主要质粒和细胞40
• 1.3 主要实验试剂40-41
• 1.4 主要实验试剂配制41-42
• 2 方法42-49
• 2.1 PBMCs分离42
• 2.2 Huh7.5 细胞及培养42
• 2.3 HCV体外培养体系的制备42-46
• 2.4 稳定过表达GV166-CLEC4M的Huh7.5 细胞系的建立46-47
• 2.5 Western Blot和RT-PCR检测Huh7.5 细胞CLEC4M的表达47-48
• 2.6 CLEC4M与HCVcc结合实验及竞争抑制实验48
• 2.7 CLEC4M对HCVcc的易感性检测48-49
• 2.8 统计学处理49
• 3 结果49-53
• 3.1 pFL-J6/JFH质粒酶切线性化及RNA转录本的鉴定49-50
• 3.2 HCV转染Huh7.5 细胞免疫荧光50
• 3.3 过表达GV166-CLEC4M的Huh7.5 细胞的检测50-51
• 3.4 免疫荧光检测CLEC4M对HCVcc的易感性的影响51-52
• 3.5 RT-PCR检测CLEC4M对HCVcc的易感性的影响52-53
• 4 讨论53-56
• 第三部分CLEC4M介导HCV负载DC的功能变化56-68
• 1 材料56-58
• 1.1 主要仪器与耗材56-57
• 1.2 主要细胞57
• 1.3 主要实验试剂57-58
• 1.4 主要溶液配制58
• 2 方法58-61
• 2.1 表达CLEC4M的DC在体外分离、培养及鉴定58-60
• 2.2 流式细胞仪检测DC表型60
• 2.3 CLEC4M介导HCVcc感染DC细胞60
• 2.4 DC细胞感染HCV后IL-12p70 和IL-10 的水平的变化60-61
• 3 结果61-66
• 3.1 光镜下观察CD14+细胞形态61-62
• 3.2 流式细胞术检测CD14 分选纯度及CELC4M表达情况62-63
• 3.3 流式细胞仪检测DC细胞表型63-64
• 3.4 CLEC4M介导DC负载HCV的竞争抑制实验64-65
• 3.5 ELISA检测DC上清IL-12p70、IL-10 的表达65-66
• 4 讨论66-68
• 小结68-69
• 参考文献69-75
• 个人简历和研究成果75-76
• 致谢76-77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王媛媛;聂青和;朱婷;;CLEC4M慢病毒载体的构建及其在K-562细胞中的表达[J];临床肝胆病杂志;2014年06期

  本文关键词：C型凝集素CLEC4M对负载HCV免疫分子的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：271873