高致病性H7N9的致病特征及疫苗对病毒的免疫效应研究

发布时间：2020-07-05 00:43

【摘要】：第一章:高致病性H7N9病毒的致病特征及生物特性研究背景:2017年,H7N9病毒发生变异,出现新型高致病性H7N9禽流感病毒感染病例。在广东高致病H7N9病人中,存在持续的病毒血症。为了进一步明确高致病性H7N9病毒的致病特点及生物特性,我们开展了以下研究。研究方法:收集患者临床资料,并采集高致病性H7N9病人的血浆和痰液进行病毒分离。采用液相芯片技术检测高致病性H7N9病人与正常人血浆的细胞因子水平。利用高致病性H7N9病毒和ZJU01毒株(2013年H7N9毒株)对小鼠进行病毒感染造模,观察两个毒株的致病特征。在感染后2天,4天,6天分别处理小鼠,取血清和器官组织,进行病毒检测和分离。利用高致病性H7N9病毒和ZJU01毒株感染A549细胞模型,提取外泌体,对外泌体中流感病毒及其基因进行检测。研究结果:高致病性H7N9病人存在病毒血症,血浆分离到活病毒。高致病H7N9病人同样存在细胞因子风暴,表现为 IL-1ra,IL-6,IP-10,IL-10,IFN-γ,MCP-3,IL-18,HGF,MCP-1异常高表达。动物实验中,高致病H7N9毒株的致病力明显强于ZJU01毒株,并导致模型小鼠病死。对高致病H7N9模型小鼠的组织器官进行病毒检测,发现多个重要脏器尤其是脑组织中检测和分离到高滴度的病毒。研究进一步证实,病毒感染的A549细胞分泌的外泌体含有病毒全基因组及具有感染性的病毒样颗粒。研究结论:高致病性H7N9病人持续存在病毒血症,诱导细胞因子风暴和重要组织器官的损害。脑部感染可能是病人致死的主要原因之一。外泌体包裹可能是病毒入血并导致肺外组织感染的重要途径之一。第二章:H7N9裂解佐剂(MF59)疫苗的长期稳定性和免疫原性研究研究背景:2013年至2018年,H7N9禽流感病毒在中国人群中造成了显著的发病率和病死率。H7N9疫苗对疾病预防至关重要。为验证MF59佐剂疫苗长期保存后是否保持稳定,我们评估了该疫苗的稳定性和免疫原性。研究方法:我们用疫苗株制备疫苗成品(抗原0.25 ml/剂量和MF59 0.25 ml/瓶)。在37±2℃环境中进行热稳定性测试,在第3、7、14、28天对血凝素含量进行检测。在25±2℃环境中进行加速稳定性试验,在第1、2、3个月进行血凝素含量检测。在5±3℃环境中进行长期稳定性测试,在第3、6、9、12、18、24、30个月进行血凝素含量检测。取保存6个月、24个月和30个月后的疫苗,对小鼠进行免疫,评估该疫苗的免疫原性。以血凝抑制和微量中和滴度来评价抗体反应。同时利用存放30个月的MF59佐剂疫苗进行二次免疫后,对小鼠进行攻毒,观察MF59佐剂疫苗的免疫保护效应。研究结果:H7N9裂解佐剂(MF59)疫苗,在37±2℃环境下可保存3天,在25±2℃可保存3个月,在5±3℃至少可保存30个月。各项指标均达到药典关于疫苗评价的标准。在保存30个月后,佐剂疫苗免疫后抗体血凝抑制效价和微量中和滴度没有明显的变化,免疫小鼠能够有效抵御H7N9病毒的感染及其致病效应。研究结论:我们的研究结果表明H7N9裂解(MF59)佐剂疫苗具有很好的稳定性。在5±3℃至少可保存30个月,适合大流行疫苗储备。第三章:A/ZJU01/PR8/2013裂解H7N9疫苗对高致病H7N9感染的小鼠的保护效应研究研究背景:自从第一例H7N9以来,已经有5波H7N9高峰,2017年出现新的高致病性H7N9毒株,为了评价A/ZJU01/PR8/2013疫苗是否还对高致病性H7N9毒株有保护效应,我们开展了此项研究。研究方法:用500μ1裂解疫苗(2.5μg HA和7.5μg HA两个剂量)或者MF59佐剂疫苗腹腔二针免疫小鼠,采集第二次免疫后14天血清,体外做血凝抑制实验,用于评价免疫血清对高致病性H7N9毒株的抗体水平。同时,对免疫后小鼠进行高致病性H7N9毒株攻毒,观察1周,2周后小鼠的生长状态,后杀死小鼠取肺进行病理及肺部病毒量检测,同时检测免疫效应。研究结果:免疫血清能够中和高致病性毒株,与ZJU01毒株比较,效价有所下降。动物实验表明,高致病性H7N9毒株对小鼠致病力明显大于ZJU01毒株,但是疫苗仍然能有效保护,MF59佐剂疫苗效果更好。研究结论:以ZJU01毒株为模板研发的H7N9裂解/佐剂疫苗,能有效地保护模型小鼠抵御高致病性H7N9的感染及其所致的病理效应。MF59佐剂疫苗的保护效果更好。当然,进一步的临床试验应该开展,同时也应该及时更新疫苗以发挥更好的效果。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R511.7
【图文】：

在显微镜下，ＨＥ染色片上可以发现肺泡组织破裂，肺损伤严重，肺内大量炎性细逡逑胞浸润。在同部位流感核心蛋白免疫组织化学染色发现肺内尤其是细支气管肺泡逡逑上皮内可检出大量的病毒抗原（图１．２）。逡逑１９逡逑

细胞因子中，有９种细胞因子和趋化因子包括ＩＬ－ｌｒａ、ＩＬ－６．丨Ｐ－１０、ＩＬ－！０、ＩＦＮ－ｙ、逡逑ＭＣＰ－３、ＩＬ－１８、ＨＧＦ、ＭＣＰ－１升高最为明显。这些细胞因子是正常人血浆中细胞逡逑因子的３０多倍（图１．３）。逡逑２０逡逑

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