结核分枝杆菌HBHA和ESAT-6对巨噬细胞极化作用的研究

发布时间：2020-07-08 00:23

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌所诱发的单一病原体致死率最高的传染性疾病之一,严重危害人类生命健康和社会公共安全。结核分枝杆菌可以入侵到机体的多个系统和器官中,引发不同部位的结核病。巨噬细胞处于机体免疫防御的第一线,在抵御外源微生物入侵中发挥重要作用。在各种微环境信号作用下,活化的巨噬细胞表现为差异化的功能表型,在早期感染中以促炎和微生物杀伤型的M1巨噬细胞为主,随感染进入后期,巨噬细胞多极化为M2型,对细菌的炎性损伤和控制力减弱,造成细菌胞内复制和感染持续。研究发现结核分枝杆菌HBHA和ESAT-6能够调控巨噬细胞功能的活化状态,影响结核分枝杆菌的感染进程和结局。本课题着重于阐明HBHA和ESAT-6对巨噬细胞极化状态的影响。第一部分方法:首先构建IL-10启动子双荧光素酶报告载体,检测重组载体转染Raw264.7细胞后萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性比值,鉴定重组载体的表达活性。SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定His GraviTrap柱纯化的原核表达蛋白ESAT-6后,用HBHA和ESAT-6分别处理pGL3-IL10 promoter重组载体和pRLSV40内参载体同时转染的Raw264.7细胞,检测各处理组的荧光素酶活性比值。结果:IL-10启动子双荧光素酶报告载体构建成功,重组载体转染组的荧光素酶活性比值比阳性对照pGL3-promoter组低(P0.01),但相对阴性对照pGL3-basic组表达明显升高(P0.01)。ESAT-6蛋白以可溶形式表达,特异性ESAT-6抗体检测到与理论分子量大小相符的蛋白条带。HBHA和ESAT-6处理组的荧光素酶活性比值与对照组相比,差异无统计学意义,提示HBHA和ESAT-6可能不具有刺激IL10启动子活性的作用。第二部分方法:对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)、Raw264.7细胞和THP-1细胞分别施加LPS+IFN-γ、IL-4、不同浓度的HBHA和ESAT-6蛋白。以ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IL-6、IL-12和TNFα。通过实时荧光定量PCR方法检测M1型极化分子标志iNOS、TNFα和CXCL-10,以及M2型极化分子标志Arg-1、CD206和CCL-22。Western blot检测细胞iNOS和Arg-1蛋白表达水平。最后通过噬菌体介导,构建结核分枝杆菌HBHA编码基因Rv0475敲除的H37Rv-ΔRv0475菌株;以pMV261-Rv0475重组载体转化Rv0475基因敲除株,构建HBHA回补株H37Rv-c-Rv0475。用结核分枝杆菌H37Rv野生株及Rv0475基因敲除及回补菌株分别感染Raw264.7细胞,Western blot检测细胞iNOS和Bcl-2蛋白表达水平。结果:结核分枝杆菌HBHA处理BMDM细胞后,培养上清中IL6、IL-12、TNFα表达量明显增加,iNOS和TNFα基因表达升高。处理后的Raw264.7细胞中IL-6分泌量增多,TNFα表达上调,THP-1细胞中CXCL-10基因表达水平升高,与ESAT-6对巨噬细胞的作用结果一致。HBHA和ESAT-6处理BMDM细胞不能增加M2极化分子标志Arg-1的蛋白表达,但都能诱导BMDM细胞和Raw264.7细胞iNOS生成增加。与野生株感染组相比,结核分枝杆菌H37Rv-ΔRv0475菌株感染Raw264.7细胞后,iNOS蛋白表达水平降低。这都证明了HBHA和ESAT-6具有促进巨噬细胞M1极化的作用。第三部分方法:对透析后的HBHA蛋白进行荧光标记,Dot blot定性评价荧光标记效率,再以HuProt?人蛋白质组芯片筛选与HBHA互相作用的靶蛋白。然后构建pGEX-5X-1/HBHA表达质粒,诱导原核表达HBHA蛋白,GST pull down进一步验证Raw264.7细胞蛋白组分ECSIT,Oncostatin M,PLEKHA8与HBHA相互作用。结果:人蛋白质组芯片筛选出41个阳性信号点。GST pull down证实HBHA与Raw264.7细胞蛋白组分ECSIT,Oncostatin M,PLEKHA8均可发生相互作用。结论:结核分枝杆菌HBHA和ESAT-6可诱导巨噬细胞向M1极化,介导HBHA发挥功能的巨噬细胞蛋白可能是ECSIT,Oncostatin M和PLEKHA8。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R52
【图文】：

图 1 结核分枝杆菌的巨噬细胞内生态位[52]肿微环境体种植于肺部，细菌和宿主因素相互作用诱导组织重塑，造成称为肉芽肿。过去十年研究结果表明，MTB 有助于增强肉芽肿利用这些结构来复制和传播[53]。当 MTB 进入宿主体内时，其首 通过宿主 CCL2 来募集巨噬细胞，然后巨噬细胞携带 MTB 穿

同类型巨噬细胞活化刺激因子与细胞内信号通路网交互作用，诱导巨噬细胞呈现出相反或协同的功能状态，最终调节机体内环境趋向于稳态。图2 巨噬细胞极化的刺激物及信号通路[91]活化的M1型巨噬细胞表现出巨噬细胞抗原提呈能力增强[92]，清除细菌，病毒或真菌感染以及抗肿瘤的能力均增加。它可以分泌一系列炎性因子如IL-1β、IL-12、IL-6、IFN-γ、TNFα和趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11等，并高表达iNOS并随之生成NO，释放蛋白水解酶和抗菌肽，增强吞噬作用，以及形成微生物吞噬体与富含水解酶的酸性溶酶体的融合[93]。TNF-α可以募集免疫细胞到感染位点并形成肉芽肿，同时有助于维持小鼠慢性感染期间肉芽肿的结构完整性。另有研究发现，使用抗结核药物治疗感染MTB的TNF-α缺陷小鼠，使其肺部细菌载量降低到不可检测的程度，但发现该小鼠肺、脾和肝中重新出现高载量的细菌感染，并且动物在13至18周内死亡[94]

空军军医大学硕士学位论文数±标准差（ ）表示，用统计因素方差分析，认为 P<0.05 差异子双荧光素酶报告载体扩增结果性引物以 PCR 方法扩增目的片段一条明亮的电泳条带，片段大小与

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本文编号：2745828