自噬在hiPS和THP-1来源巨噬细胞抗结核免疫作用的比较研究

发布时间：2020-07-19 01:15

【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)在当今依旧是一个全球性的重要公共卫生问题。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原体,MTB与其宿主巨噬细胞(Macrophages,Mφ)的相互作用对结核病的病理发生和发展起着重要的作用。目前研究中采用的巨噬细胞多为肿瘤细胞系或外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)来源的巨噬细胞,其存在着因遗传结构改变导致功能缺失或细胞获取困难等问题。诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)及定向诱导分化技术的出现为体外获取巨噬细胞提供了途径,为最终深入揭示巨噬细胞抗结核免疫机制提供了新的途径。研究已证实,在MTB与巨噬细胞相互作用的过程中,细胞自噬发挥着重要的作用,但具体机制并不清楚。为了探讨自噬在人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPS)来源的巨噬细胞(hiPS-Mφ)和THP-1来源的巨噬细胞(THP-1-Mφ)中抗结核免疫的异同,本研究首先利用类胚体(Embryonic body,EB)分化诱导法将hiPS细胞在体外诱导分化为巨噬细胞(hiPS-Mφ),并对获得的巨噬细胞样细胞进行形态学和生物学功能鉴定。结果证实hiPS-Mφ具有巨噬细胞所特有的特征,包括Giemsa染色为紫色、具有吞噬墨水能力,说明通过EB诱导方法可获得具有生物学功能的巨噬细胞。在此基础上,分别提取结核分枝杆菌弱毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)感染的hiPS-Mφ和THP-1-Mφ细胞的总RNA,通过高通量测序技术分析基因表达的差异。结果发现,与hiPS-Mφ相比,BCG感染hiPS-Mφ后有832个基因表达有显著性差异(P0.05),其中包括572个基因显著上调,260个基因显著下调;与THP-1-Mφ相比,BCG感染THP-1-Mφ后有397个基因表达有显著性差异(P0.05),其中包括211个基因显著上调,186个基因显著下调。差异表达的基因KEGG富集分析发现,BCG感染hiPS-Mφ与THP-1-Mφ后,在结核病、Toll样受体、TNF、P13K-AKT、吞噬体、结节样受体、NF-kappaB、mTOR、MAPK、IL-17、细胞因子-细胞因子受体互作、趋化因子及自噬和凋亡通路都有不同程度的富集。利用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)、透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)和激光共聚焦显微镜观察BCG感染后hiPS-Mφ和THP-1-Mφ细胞的亚显微结构。结果发现,BCG感染hiPS-Mφ与THP-1-Mcφ后,细胞表面发生皱缩、裂解等现象,同时细胞内自噬体数目增多;用表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒感染细胞,在激光共聚焦显微镜下观察到BCG感染的hiPS-Mφ和THP-1-Mφ后细胞自噬体增多。最后,通过qPCR和Western Blot检测证实,与自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)处理组比较,BCG 感染 hiPS-Mcφ 和 THP-1-Mcφ 后显著增加了自噬相关基因LC3B的表达(P0.01),同时抑制了自噬相关基因GABARAPL2和P62的表达(P0.01)。并初步证实BCG感染后通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬相关基因的表达进而促进自噬的发生。但在不同来源的巨噬细胞中发现,BCG感染后诱导自噬相关基因的表达存在有一定的差异,表现在hiPS-Mφ中的DDIT4和EXOC8显著上调(P0.01),而THP-1-Mφ中的RAB7B和CTSD显著下调(P0.01),说明不同来源的巨噬细胞在BCG诱导自噬调控机制可能存在有差异。总之,本研究通过EB分化的方法,成功获得了 hiPS来源的巨噬细胞。通过转录组测序分析、qPCR和WB验证及细胞亚显微结构观察发现,BCG感染hiPS-Mφ和THP-1-Mφ后通过调控自噬相关基因表达促进了细胞自噬的发生;但BCG感染不同来源的巨噬细胞诱导自噬发生的机制也存在有一定的差别,此结果为进一步研究自噬在巨噬细胞抗结核免疫机制中的作用提供了新的思路。
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R52
【图文】：

诱导分化,标尺,悬浮细胞,单核细胞

（Ａ）：培养ｈｉＰＳ；邋（Ｂ）：邋ｈｉＰＳ长满；（Ｃ）：邋ＥＢ形成第２ｄ；邋（Ｄ）：邋ＥＢ培养到５邋ｄ左右，开始成熟；（Ｅ）：逡逑添加Ｍ－ＣＳＦ和ＩＬ－３，邋ＥＢ开始逐渐贴壁；（Ｆ）：邋ＥＢ几乎完全贴壁，开始朝单核细胞分化；（Ｇ）：培养逡逑皿中逐渐有悬浮细胞产生，每４－５邋ｄ收集一次悬浮细胞，并更换新鲜Ｍｏｎｏｃｙｔｅ培养基；（Ｈ）：收集悬逡逑浮细胞，并添加原先两倍浓度的Ｍ－ＣＳＦ和ＩＬ－３刺激单核细胞向巨噬细胞分化；（Ｉ）：收集的具有典型逡逑巨噬细胞培形态特征的细胞。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋ｈｉＰＳ邋ｉｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｔｏ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ邋ｉｎｔｏ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ逡逑（Ａ）：邋ｈｉＰＳ邋ｃｕｌｔｕｒｅ；邋（Ｂ）：邋ｈｉＰＳ邋ｏｖｅｒｇｒｏｗｎ；邋（Ｃ）：邋ＥＢ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋２ｎｄ；邋（Ｄ）：邋ＥＢ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋５邋ｄａｙｓ，邋ＥＢ邋ｂｅｇａｎ邋ｔｏ逡逑ｍａｔｕｒｅ；邋（Ｅ）：邋Ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｍ－ＣＳＦ邋ａｎｄ邋ＩＬ－邋３，邋ＥＢ邋ｂｅｇａｎ邋ｔｏ邋ｇｒａｄｕａｌｌｙ邋ｇｒｏｗ邋ａｄｈｅｒｅｎｔ；邋（Ｆ）：邋ＥＢ邋ｉｓ邋ａｌｍｏｓｔ逡逑ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ邋ａｔｔａｃｈｅｄ邋ａｎｄ邋ｂｅｇｉｎｓ邋ｔｏ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ邋ｉｎｔｏ邋ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ；邋（Ｇ）：邋Ｇｒａｄｕａｌｌｙ邋ｐｒｏｄｕｃｅ邋ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ邋ｃｅｌｌｓ，逡逑ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ｎｅｅｄ邋ｔｏ邋ｂｅ邋ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ邋ｅｖｅｒｙ邋４－５邋ｄａｙｓ，邋ａｎｄ邋ａｄｄｉｎｇ邋ｆｒｅｓｈ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｏｆ邋Ｍｏｎｏｃｙｔｅ；邋（Ｈ）：邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ逡逑ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｎｄ

标尺,巨噬细胞,吞噬功能,墨水

（Ａ）ｈｉＰＳ－Ｍｃｐ；邋（Ｂ）ＴＨＰ－ｌ－Ｍｃｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２邋Ｇｉｍｅｓａ邋ｓｔａｉｎ邋（Ｂａｒ邋＝邋１００邋ｐｍ）逡逑（Ａ）邋ｈｉＰＳ－Ｍ（ｐ；邋（Ｂ）邋ＴＨＰ－１邋－Ｍ（ｐ逡逑３．３吞噬功能检测逡逑通过对获得的具有巨噬细胞样的细胞进行墨水吞噬，测定其吞噬墨水颗粒水平，进逡逑而判断其吞噬能力，结果如图３．３所示，ｈｉＰＳ和ＴＨＰ－１来源的巨噬细胞样的细胞的细胞逡逑质中都有墨汁颗粒，表明这两种来源的巨噬细胞样细胞均具有吞噬功能。逡逑．、、？邋Ｖ－邋＊逦ｒ逦Ａ－逦必－逡逑，．：、＇邋灟．．，、＇．逡逑

吞噬功能,标尺,巨噬细胞

逦自噬在ｈｉＰＳ和ＴＨＰ－１来源巨噬细胞抗结核免疫作用的比较研究逡逑？邋？逦ｄ撕４逡逑图３．２邋Ｇｉｍｅｓａ染色（标尺示１００邋ｆｉｎｉ）逡逑（Ａ）ｈｉＰＳ－Ｍｃｐ；邋（Ｂ）ＴＨＰ－ｌ－Ｍｃｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２邋Ｇｉｍｅｓａ邋ｓｔａｉｎ邋（Ｂａｒ邋＝邋１００邋ｐｍ）逡逑（Ａ）邋ｈｉＰＳ－Ｍ（ｐ；邋（Ｂ）邋ＴＨＰ－１邋－Ｍ（ｐ逡逑３．３吞噬功能检测逡逑通过对获得的具有巨噬细胞样的细胞进行墨水吞噬，测定其吞噬墨水颗粒水平，进逡逑而判断其吞噬能力，结果如图３．３所示，ｈｉＰＳ和ＴＨＰ－１来源的巨噬细胞样的细胞的细胞逡逑质中都有墨汁颗粒，表明这两种来源的巨噬细胞样细胞均具有吞噬功能。逡逑．、、？邋Ｖ－邋＊逦ｒ逦Ａ－逦必－逡逑，．：、＇邋灟，．心．，、＇．逡逑．％９－，，邋ｉｆ邋／邋＇邋＾邋－逦、

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