乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭发生发展的分子标志物鉴定与研究

发布时间：2020-07-28 23:08

【摘要】：背景：乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(Hepatitis B-related Acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)在亚太地区有很高的死亡率,但是它的发生发展机制尚不清楚。建立敏感且特异的生物标志物,用于HBV-ACLF的早期诊断和疾病进展预测,对于确定哪些病人需要尽早地治疗和接受肝移植手术非常重要。最近,已有研究报道将外周血中的微小RNA (miRNA)和信号蛋白作为很多疾病无创诊断的潜在生物标志物,其中也包括一些肝脏疾病。材料和方法：在第一章中,我们用高通量测序技术研究来自HBV-ACLF组、慢性乙型肝炎(CHB)组和健康对照(Healthy)组的12例(每组4例)样本外周血单个核细胞(PBMC)中的miRNA表达谱,从中寻找HBV-ACLF的全新miRNA标志物。首先提取所有样本的PBMC中的miRNA,用HiSeq 2000测序仪对其进行深度测序；然后使用miRDeep2软件从测序结果中分析已知miRNA的表达量并鉴定未知的全新miRNA,再用DESeq2分析在HBV-ACLF中表达失调的miRNA;最后,在另外的30例(每组10例)样本中用基于TaqMan探针技术的实时定量PCR方法(qRT-PCR)来验证失调miRNA的表达量和确认全新miRNA的表达情况。在第二章中,我们用含有274个人类细胞因子蛋白抗体的芯片检测来自HBV-ACLF组、CHB组和Healthy组的15例(每组5例)血清样本中的信号蛋白表达情况,从中筛选全新的HBV-ACLF血清蛋白标志物。用芯片显著性分析(SAM)和芯片预测分析(PAM)两种方法找出差异表达的蛋白,然后用酶联免疫吸附测定法(ELISA)在279例HBV-ACLF样本、116例CHB样本和20例健康样本中验证显著差异蛋白的表达量,再对各组样本的验证结果进行聚类分析,找出能将HBV-ACLF样本与CHB和Healthy样本进行正确区分的信号蛋白。此外,我们根据HBV-ACLF样本的三个月死亡情况和验证结果中信号蛋白的表达水平,通过生物信息学分析找出与HBV-ACLF死亡率密切相关的信号蛋白,然后将另外136例HBV-ACLF样本作为外部验证组,用于验证该信号蛋白预测HBV-ACLF死亡率的能力。结果：在第一章中,用高通量测序技术对HBV-ACLF组、CHB组和Healthy组的PBMC中miRNA表达谱进行研究后,我们发现有1167个已知miRNA和107个全新miRNA至少在一个样本中有表达,其中,78个miRNA在HBV-ACLF病人中的表达水平与CHB病人和健康人中的相比有显著差异。通过进一步分析,我们找到了7个上调和1个下调的miRNA,它们在HBV-ACLF病人中的表达水平与CHB 和 Healthy组中的相比都有4倍以上的变化,同时它们在HBV-ACLF组中的测序读长片段(Read)数量高于该组的中位数。用qRT-PCR方法对这8个miRNA的表达量进行验证后,发现其中6个miRNA (hsa-miR-21-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-374a-3p和hsa-miR-542-3p)的表达量在HBV-ACLF病人中显著升高,这个结果与高通量测序结果一致,但是另外两个miRNA在HBV-ACLF病人中的表达水平与其他两组相比没有显著变化。Gene Ontology (GO)通路分析显示上述6个差异表达miRNA的靶基因主要参与了系统发育、信号调节、RNA代谢过程和基因表达等生物学过程。此外,我们用qRT-PCR方法对5个在测序结果中表达量最高的全新miRNA进行检测,发现它们在三组样本的PBMC中均有表达,而且其中两个在HBV-ACLF中的表达量显著上升。在第二章中,细胞因子抗体芯片的初始筛选找到了在]HBV-ACLF病人中显著差异表达的15个蛋白,这15个蛋白主要参与了细胞识别、炎症、细胞粘附、血管生成和细胞调控等生物学过程。其中有6个蛋白(肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞炎症蛋白3a (MIP-3a).癌胚抗原相关细胞黏附分子1 (CEACAM1)、生长分化因子15(GDF15)、选择蛋白E (E-selectin)和骨桥蛋白(Osteopontin))在]HBV-ACLF病人中的表达量远高于在CHB病人和健康人中的表达量。用ELISA方法在279例HBV-ACLF病人与116例CHB病人和20例健康人的血清样本中对这6个蛋白的表达量进行验证,验证结果与抗体芯片的结果基本一致。通过聚类分析,发现仅用HGF和GDF15就可以将HBV-ACLF组样本与CHB和Healthy组样本正确区分开。此外,我们发现在ELISA实验组中MIP-α与HBV-ACLF病人的死亡率密切相关,外部验证组的结果也显示MIP-3α可以用于预测HBV-ACLF病人的死亡率。同时,免疫组化结果显示HGF, GDF15和MIP-3α在HBV-ACLF来源的肝组织中表达为阳性,而在CHB和Healthy来源的肝组织中表达为阴性。结论：HBV-ACLF病人PBMC中的miRNA表达谱和血清中的信号蛋白表达水平在该疾病的发生发展过程中发生了明显变化。6个在HBV-ACLF病人PBMC中高表达的miRNA可以作为全新生物标志物用于反映疾病的发展进程；在PBMC中还存在着很多全新miRNA,而且它们的表达水平也可能与HBV-ACLF相关。HGF和GDF15能够作为HBV-ACLF全新的血清标志物,用于该疾病的早期诊断；MIP-3α有潜力作为全新的血清预后标志物用于预测HBV-ACLF的死亡率。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62

【参考文献】