利用NTCP-Huh7细胞模型研究EFTUD2对HBV的抑制作用

发布时间：2020-08-01 22:37

【摘要】：研究背景与目的:乙型病毒性肝炎一直是全球公共健康的重要威胁。为了研究HBV,国内外曾使用过多种细胞模型,如转染了HBV质粒的肝癌细胞系(Hep G2.215和Hep AD38),这类细胞缺失了HBV入侵细胞这一进程;而人原代肝细胞和Hep RG细胞虽然能够在体外感染HBV,但是培养方式复杂,并且不能无限传代;肝癌源性细胞虽然可以无限传代,但是细胞表面NTCP的表达量低下,难以感染HBV病毒,以上细胞均具有一定局限性。2012年11月,李文辉教授宣布发现了NTCP即为HBV功能性受体,实现了HBV在体外感染肝癌细胞系,填补了这个空缺。现有的技术手段大多把携带NTCP基因片段的质粒瞬时转染入肝癌细胞中,NTCP的表达较为短暂,导致HBV感染此种细胞模型的效率低下且不稳定。鉴于此种弊端,本文通过将钠离子牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)与GV-358慢病毒载体链接,合成了GV358-NTCP重组慢病毒载体,然后将GV358-NTCP转染入Huh7细胞,建立出可以在包膜稳定表达NTCP蛋白的Huh7细胞(NTCP-Huh7)。检测此种细胞被乙型肝炎病毒(HBV)感染后各种病毒相关蛋白的表达,以验证稳定表达NTCP的Huh7细胞是否具有HBV易感性。然后通过将p EFTUD2质粒转染入细胞,使NTCP-Huh7过表达EFTUD2,再次测定上清中病毒相关蛋白和HBV DNA的表达,以验证EFTUD2的抑制作用。最后将p EFTUD2和si RIG-1共转染入细胞,测定细胞上清HBV DNA含量,确证EFTUD2是否通过RIG-1依赖性途径发挥抗病毒作用。方法:1.构建GV358-NTCP重组质粒,然后用GV358-NTCP感染Huh7细胞,构建出NTCP-Huh7细胞,此细胞可以稳定表达NTCP基因。2.收集Hep AD38细胞上清,浓缩提取HBV后以500 qeg/cell的浓度与NTCPHuh7细胞共孵育,细胞培养板在1000g/min离心力下离心30分钟,而后在细胞培养箱内培养18小时,此后换液为肝细胞维持培养基,在第2、4、6、8、10、12天收集细胞上清,然后用免疫荧光、ELISA、q PCR法等技术检测病毒蛋白表达以及HBV DNA和HBV ccc DNA的复制,确定NTCP-Huh7重组细胞是否具有HBV易感性。3.使用p EFTUD2处理稳定表达HBV的NTCP-Huh7细胞系,观察不同组别(对照组,EFTUD2过表达组)细胞上清中的HBV DNA、HBe Ag、HBs Ag的水平,进一步确证EFTUD2抗HBV效应。4,将p EFTUD2和si RIG-1共转染入细胞,比较未处理组、EFTUD2过表达组、RIG-I敲低组、EFTUD2过表达同时RIG-I敲低组细胞上清中HBV DNA含量,以验证EFTUD2是否通过RIG-I依赖性途径发挥抗病毒作用。结果:1.PCR鉴定和测序结果证明重组慢病毒GV358-NTCP构建完成,荧光法测得GV358-NTCP重组质粒的浓度为2×108TU/ml。使用GV358-NTCP感染Huh7细胞,经过为期一周的药物筛选,可见表达绿色荧光蛋白的阳性细胞由之前的10%左后增加到高于90%。Western blot结果说明NTCP-Huh7细胞株可表达NTCP。2.使用HBV感染NTCP-Huh7,然后对上清做检测。ELISA结果显示,第4,6,8,10天NTCP-Huh7细胞上清中HBs Ag以及HBe Ag的含量均高于Huh7组(P0.05),第8天NTCP-Huh7组HBs Ag的OD值(0.866±0.040)和HBe Ag的OD值(0.603±0.053)达到顶峰。取第8天的细胞进行免疫荧光染色,结果显示NTCP-Huh7中可表达HBc Ag。q PCR法显示:第4,6,8,10,12天NTCP-Huh7组HBV DNA的含量均高于Huh7组(P0.05),第8天NTCP-Huh7组的HBV DNA分泌量(9893.931±741.754 IU/ml)达到高峰。Real-Time PCR法显示:在感染HBV后的第4,6,8,10,12天,NTCP-Huh7组上清中HBV ccc DNA含量均高于Huh7组,且在第6天HBV ccc DNA表达量达到顶峰。3,将p EFTUD2导入NTCP-Huh7和Hep G2.2.15细胞系。在Hep G2.2.15中,对照组和EFTUD2过表达组细胞上清中的HBs Ag含量分别为3.180±0.132、1.779±0.096,HBe Ag含量分别为3.613±0.021、2.101±0.065。当p EFTUD2的量为0.5ug、1μg或2μg时,HBV DNA的含量分别为57738.333±1281.097、35607.971±1902.023、30296.495±687.261。在NTCP-Huh7细胞中,对照组和EFTUD2过表达组细胞上清中的HBs Ag含量分别为0.782±0.028、0.358±0.022,HBe Ag为0.620±0.024、0.267±0.010。EFTUD2对HBV具有阻断作用。4,未处理组、EFTUD2过表达组、RIG-I敲低组、EFTUD2过表达同时RIG-I敲低组细胞上清中HBV DNA含量分别为60983.076±1392.366、30889.608±1341.288、64242.599±1220.242、60469.652±1287.59。对比分析发现EFTUD2可通过RIG-I依赖性途径发挥抗病毒作用。结论:构建GV358-NTCP重组质粒,转染入Huh7后获得的NTCP-Huh7细胞具有HBV易感性。EFTUD2可通过RIG-I依赖性途径发挥抗HBV作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62
【图文】：

电泳图,电泳图,基因,慢病毒

NTCP基因电泳图

重组载体,阳性克隆,阳性对照,对照组

图 2 重组载体阳性克隆 PCR 鉴定FIG. 2 Positive clone PCR identification of recombinant carrier.1：空白对照(ddH2O)；2:阴性对照(空载自连对照组)；3：阳性对照(GAPDH)；4：Marker；5挑取的 1~8 号单克隆3.2 使用 GV358-NTCP 慢病毒载体转染 293T 细胞

荧光,转染,视野,白光

图 3 GV358-NTCP 慢病毒载体转染 293T 细胞 4 天后的荧光表达结果× 100FIG. 3 To observe the fluorescence expression of GV358-NTCP slow virus vector aftertransfection of 293T cells.A：白光视野； B：荧光视野

【参考文献】