NKG2D启动子甲基化对乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断价值的研究

发布时间：2020-08-11 21:47

【摘要】：研究背景全球大多数的(70%至90%)原发性肝癌是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),在全球常见癌症中排名第五位,在与癌症相关的死亡原因中排名第二位,主要与乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)或丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的慢性感染有关。HBV或HCV的慢性感染在低、中等收入国家更为普遍,据估计中国占全世界肝癌病例和死亡的50%。据统计,2005年中国肝癌死亡人数为339,308人,其中男性为246,808人,女性为92,500人,肝癌病例数估计为370,236人,其中男性为274,562人,女性为95,674人。虽然肝癌的诊疗水平较前提高,但超过一半的肝癌患者在确诊后12个月内死亡,不到6%的患者平均存活率为5年。因此,及早地诊断及治疗肝癌是必要的。目前,肝癌的诊断与筛查的主要手段包括血清学检查及影像学检查,如甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)、超声(Ultrasound,US)、计算机断层扫描(Computed tomography,CT)及磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)。AFP是目前临床上最常使用的血清学筛查指标。但已有研究表明,AFP并不具备足够的敏感性及特异性。AFP在孕期可以升高,并且已经报道了在性腺肿瘤(生殖细胞和非生殖细胞)及其他恶性肿瘤存在异常升高。还有一些研究报道,在不患有肝癌的慢性肝病患者和急、慢性病毒性肝炎患者中存在血清AFP的异常升高。尽管AFP值大于400 ng/ml被用于肝癌的诊断,但仅在一小部分肝癌患者中会出现这种高水平的AFP。AFP在鉴别肝癌与良性肝病中的效用也被认为受到高假阴性率和假阳性率的限制。由于肝癌在超声上有不同的反射方式,因此14项评估监测超声的研究中报道超声具有较低的敏感性。CT具有辐射暴露和相对低的软组织对比度。MRI更耗时,更容易产生伪影,并且需要更多的专业知识来分析解释图像,可用性较低。肝癌诊断的金标准为肝脏活检及病理学分析,但肝脏活检为侵袭性检查,具有一定的创伤性。因此,寻找新的非侵袭性的生物标志物来用于检测早期的肝细胞癌是非常有必要的。自然杀伤细胞受体组2D(Natural killer cell receptor group 2D,NKG2D)是先天免疫系统中一种非常重要的活化受体。它对靶细胞的杀伤作用是通过识别靶细胞表面的配体、传递激活信号并激活免疫系统来实现的。NKG2D在肿瘤的免疫调节中起重要作用。它在肿瘤发生的早期阶段就会启动先天免疫监视和清除的功能。已经有研究表明,在肿瘤患者的外周血中,NKG2D受体的表达水平明显下降。现在人们普遍认为癌症是由遗传和表观遗传改变或功能障碍的综合作用引起的。虽然癌症发生的根本原因仍然很难明确,但是环境因素能够改变表观基因组并最终增加患癌症的风险。DNA甲基化是表观遗传改变中最常见的方式,我们推测其参与NKG2D基因的调控。研究目的检测HCC患者、慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者及健康对照者(Healthy controls,HCs)的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中NKG2D启动子甲基化水平的差异,从而探究其在HCC中的诊断价值。研究方法本研究纳入了 101例HCC患者,56例CHB患者及32例HCs。采集研究对象的外周血,提取外周血中的单个核细胞,从单个核细胞中提取DNA及RNA,对DNA进行甲基化修饰,对RNA进行逆转录。我们通过甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)探究NKG2D启动子甲基化状态,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测mRNA表达水平。结果1.三组基本临床特征的比较:HCC患者组、CHB患者组、HCs组在年龄、性别上差异无统计学意义(P0.05),在ALT、AST、TBIL、ALB、Cr上均有明显差异(P均0.001)。HCC患者组、CHB患者组HBsAg、HBV DNA、INR、PTA、AFP无明显差异(P0.05),HBeAg差异具有统计学意义(P0.001)。2.HCC患者中NKG2D启动子的甲基化频率(63/101,62.4%)明显高于CHB患者(10/56,17.9%;X2=28.701,P0.001)和HCs(0/32,0.0%;X2=37.925,P0.001)。。CHB患者NKG2D启动子甲基化频率也高于HCs(X2=6.447,P=0.011)。3.在HCC患者中,NKG2D启动子甲基化组与非甲基化组的TNM分期有统计学差异(X2=5.477,P=0.019),两组的年龄(Z=-0.232,P=0.817)、性别(X2=0.926,P=0.336)、吸烟(X2=0.404,P=0.525)、饮酒(X2=0.701,P=0.402)、HBsAg(Z=-1.609,P=0.108)、HBeAg(X2=1.311,P=0.252)、HBV DNA(X2=0.029,P=0.865)、ALT(Z=-1.459,P=0.145)、AST(Z=-0.519,P=0.604)、TBIL(Z=-0.638,P=0.524)、ALB(Z=-1.911,P=0.056)、、INR(Z=-0.224,P=0.822)、、PTA(Z=-0.004,P=0.997)、Cr(Z=-1.893,P=0.058)、AFP(Z=-0.175,P=0.861)、肿瘤大小(X2=1.473,P=0.225)、肿瘤数量(X2=0.019,P=0.890)、血管侵袭(X2=0.901,P=0.342)、CTP分期(X2=0.936,P=0.626)、组织学分级(X2=3.520,P=0.172)无明显差异。此外,以年龄、性别、HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST、TBIL、ALB、INR、PTA、Cr、AFP、肿瘤数量、有无血管侵袭、肿瘤大小、TNM分期作为自变量,以NKG2D启动子是否甲基化作为因变量,进行多变量Logistic回归分析,结果显示TNM分期增加NKG2D启动子甲基化。4.HCC患者的NKG2D mRNA水平显著低于CHB患者(Z=-5.015,PP0.001)和HCs(Z=-8.296,P0.001)。CHB患者的NKG2D mRNA水平与HCs组的NKG2D mRNA水平差异也具有统计学意义(Z=-6.900,P0.001)。此外,HCC患者甲基化组的NKG2D mRNA水平低于非甲基化组NKG2D mRNA水平(Z=-2.236,P=0.025)。HCC患者中NKG2D启动子甲基化状态与NKG2D mRNA水平呈负相关(r=-0.224,P=0.025)。HCC患者HBeAg(+)组与HBeAg(-)组NKG2D mRNA水平无明显差异(Z=-1.472,P=0.141),HBV DNA(+)组NKG2D mRNA表达水平低于HBV DNA(-)组(Z=-2.243,P=0.025),TNM分期(Ⅲ/Ⅳ)组NKG2D mRNA表达水平低于TNM分期(Ⅰ/Ⅱ)组(Z=-3.404,P=0.001),血管侵袭(+)组NKG2D mRNA表达水平低于血管侵袭(-)组(Z=-2.302,P=0.021)。HCC患者中NKG2D mRNA水平与AFP(r=-0.294,P=0.003)、TBIL(r=-0.207,P=0.037)、AST(r=-0.224,P=0.024)、TNM分期(r=-0.340,P0.001)、HBV DNA(r=-0.224,P=0.024)、血管侵袭(r=-0.230,P=0.021)具有相关性,与ALT(r=-0.164,P=0.102)、HBsAg(r=0.015,P=0.884)、INR(r=0.121,P=0.228)、PTA(r=0.127,P=0.204)、ALB(r=0.147,P=0.141)无相关性。5.NKG2D启动子甲基化对区分HCC和CHB的敏感性为62.4%,特异性为82.1%,阳性预测价值为86.3%,阴性预测价值为54.8%。AFP对区分HCC和CHB的敏感性为48.5%,特异性为50.0%,阳性预测价值为63.6%,阴性预测价值为35.0%。当AFP与NKG2D启动子甲基化联合,区分HCC和CHB的敏感性为81.2%,特异性为48.2%,阳性预测价值为73.9%,阴性预测价值为58.7%。在HCC诊断中,与单独的AFP相比,AFP与NKG2D启动子甲基化联合具有更高的敏感性(X2=23.651,P0.001)及阴性预测价值(X2=6.667,P=0.010),在特异性(X2=0.036,P=0.850)及阳性预测价值(X2=2.255,P=0.133)上差异无统计学意义。当AFP大于或等于20 ng/ml时,NKG2D启动子甲基化组中的HCC检出率(30/39,76.9%)明显高于未甲基化组(19/38,50.0%;X2=6.029,P=0.014)。当AFP小于20 ng/ml时,甲基化组中HCC的检出率(33/34,97.1%)也高于未甲基化组(19/46,41.3%;X2=26.713,P0.001)。区分HCC和CHB的NKG2D启动子甲基化的受试者工作特征曲线下面积(Area under the receiver operating characteristic curves,AUC)为 0.723(SE 0.0354,95%CI 0.646-0.791),明显高于AFP水平的AUC(AUC 0.569,SE 0.0477,95%CI 0.488-0.648),差异具有统计学意义(P=0.0037)。两种标志物的组合的AUC(AUC 0.647,SE 0.0389,95%CI 0.567-0.722)也高于单独的AFP水平的AUC(AUC 0.569,SE 0.0477,95%CI 0.488-0.648;P=0.0141)。结论1.HCC患者中NKG2D启动子存在异常甲基化,并且其甲基化水平明显高于CHB患者及HCs,mRNA表达水平显著低于CHB患者及HCs,这提示NKG2D启动子高甲基化可能是导致基因表达水平下调的原因。2.在HCC患者中,NKG2D启动子甲基化组与非甲基化组的TNM分期有统计学差异,并且TNM分期增加NKG2D启动子甲基化。TNM分期是评估肝癌进展的重要指标,提示NKG2D启动子甲基化可能与肝癌进展有关。HCC mRNA表达水平与HBV DNA、TNM分期、血管侵袭、AFP、TBIL和AST呈明显负相关。这些指标可反映病变严重程度,提示NKG2D启动子甲基化可能与病变严重程度有关。3.NKG2D启动子甲基化在肝癌中有良好的预测价值,这提示我们NKG2D启动子甲基化可作为肝癌诊断的非侵入性标志物,并且为肝癌的诊断和治疗提供了新的思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;R512.62

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