禽流感病毒及其感染风险的流行病学监测研究

发布时间：2020-08-21 00:47

【摘要】：一、研究背景禽流感病毒(avian influenza viruses,AIVs)宿主分布广泛,目前已经突破种属屏障,不仅造成野禽和家禽感染,而且具备直接感染人类的能力,严重危害人类健康和公共卫生安全。野禽是禽流感病毒的自然宿主,可作为病毒基因库,提供遗传多样性。感染AIVs的野禽个体大多数情况下无明显症状,能够长时间携带病毒迁徙,通过间接污染环境水体或直接接触传播AIVs。禽养殖场和活禽市场中普遍存在AIVs的感染流行。我国禽养殖业饲养总量大,密度高,个别被感染家禽因无明显症状得不到及时处理,家禽普遍感染低致病性禽流感病毒。活禽市场是人类感染AIVs的主要暴露场所。大规模的跨区域活禽运输和交易,人为的增加了病毒重配机会,提高了产生新型流感病毒的可能性。AIVs在禽养殖场和活禽市场中的普遍流行必然增加职业暴露人员感染的风险,并且禽暴露人群可能成为AIVs向一般人群传播的桥梁。猪作为流感病毒的混合器,在不同种属间传播起特殊作用。职业接触猪的工人同样需要关注,以便于更全面的分析和评价感染相关危险因素。经流行病学调查显示,大部分人感染禽流感病例有禽类接触史。而我国家禽养殖规模大,禽畜混养的特点和部分地区居民有购买活禽加工食用的生活方式,也增大了人类感染的风险。现有研究多为某一时间的横断面研究,缺乏长期动态监测。通过开展对哨点动物,禽养殖场,活禽市场中AIVs流行情况和职业暴露人群中感染风险的监测研究,对流感的防控具有重要意义。二、研究目的在江苏省无锡市太湖开展哨点动物鸡感染禽流感病毒的监测,探讨自然条件下野禽向家禽传播禽流感病毒的传播规律。开展为期三年的对无锡市禽养殖场和活禽交易市场中家禽和环境的动态监测,明确当地禽流感病毒的流行情况,亚型分布,掌握已知或新发禽流感病毒生物学特征,探索病毒变异与遗传进化规律。同时进行职业暴露人群和一般人群的队列研究,确定职业暴露人群中禽流感病毒的感染率与发病率,评估不同亚型禽流感病毒的感染情况,掌握影响职业暴露人群和普通人群感染的危险因素,为将来流感病毒的预防和控制提供参考意见。三、研究方法2014年1月至10月在江苏省无锡市太湖,对无特定病原体(specific pathogen free,SPF)哨点动物鸡进行监测,连续(4月至6月期间每周1次,其余时间每月1次)采集泄殖腔和咽拭子标本,拍摄记录与野禽接触的过程。通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)筛检甲型流感阳性标本,阳性标本利用SPF鸡胚培养,复合感染样本利用空斑形成试验分离,通过高通量测序技术获得全基因组序列,分析遗传进化特征。2013年7月至2016年6月间,在无锡市禽养殖场和活禽市场中进行主动监测,每个月采集一次禽咽拭子和相应环境标本(粪便,污水,笼圈表面擦拭物等),经过qRT-PCR筛检甲型流感阳性标本,并利用针对H5、H7、H9亚型的特异引物进一步分型,同时接种于SPF鸡胚或犬肾细胞进行病毒的分离培养,采用一步法反转录PCR扩增全基因组或高通量测序技术获得序列结果,明确禽流感病毒在家禽中感染情况和遗传进化特征。2013年7月至2016年6月同时期内,将养殖场和活禽市场符合纳入条件的职业暴露人群(饲养、屠宰、销售和运输等)和与其年龄匹配的一般人群纳入队列研究,进行为期3年随访,每年以问卷的形式收集人口学信息和暴露动物种类,时间,方式等信息,并采集血清,用于血凝抑制实验(HI)和微量中和试验(MN)检测H7N9,H9N2,H5N1和H5N6亚型抗体水平,所用抗原来自本研究同时期从当地活禽市场中分离得到的毒株。计量资料使用t检验或方差分析,计数资料使用χ~2检验或精确检验,均为双侧概率检验,P值小于0.05认为存在统计学差异。采用单因素和多因素Logistic回归分析计算比值比(odds ratio,OR)和其95%可信区间(confidence interval,CI)用于表示相对危险度,使用泊松回归模型计算发病率比IRR(incidence rate ratio)和其95%可信区间,并依据年龄和性别进行调整,建立感染危险因素模型,确定职业暴露人群不同亚型禽流感病毒发病率,感染率和相关危险因素。四、研究结果2014年1月至10月期间共采集1623份哨点鸡的肛咽拭子样本,其中364(22.4%)份甲型流感病毒阳性,分离到3株AIV毒株其中两份样本为H7N2和H9N2共同感染,一份样本中则含有H5和N6基因片段。系统发育分析显示H7N2毒株是由H7N9和H9N2病毒重配形成的低致病株,而H5N6毒株是由2.3.4分支H5N1病毒和H6N6病毒重配形成的高致病株。哨点鸡通过与野生禽鸟接触或共享饲料和水,感染禽流感病毒,最终分离到的毒株与从我国病人和家禽中分离到的毒株高度同源,提示野生禽鸟在向家禽传播新型禽流感病毒中起到重要作用。2013年7月至2016年6月对无锡市禽养殖场监测期间,共采集禽咽拭子标本240份及相应环境标本284份,共有84(16.0%)份标本甲型流感病毒阳性,其中24(4.6%)份标本H9亚型阳性,2(0.4%)份标本H5亚型阳性,未发现复合感染现象。家禽中甲型流感阳性率显著高于相应环境样本(23.3%vs.9.9%,?~2=17.54,P0.001)。通过分离测序,最终获得4株H9N2病毒,HA和NA基因均属于Y280系,与我国大陆地区家禽中广泛流行的H9N2优势株高度近似。HA蛋白具有Q226L(H3编号)位点突变,对人类受体具有结合作用,同时NA蛋白具有R292K,M2蛋白具有S31N位点突变,提示对神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺类药物不再敏感。同时期对无锡市活禽市场的家禽和环境的监测中,累计采集3121份标本,其中甲型流感核酸检测阳性726份(23.3%),包括466/2010份(23.2%)咽拭子,145/590份(24.5%)环境表面拭子和115/521份(22.0%)粪便/污水样本,差异无统计学意义(?~2=0.99,P=0.61)。726份甲型流感阳性标本中,229份(31.5%),27份(3.7%)和25份(3.4%)分别为H9,H7和H5亚型病毒感染。对基因序列的分析发现,在活禽市场中至少流行10种不同禽流感病毒亚型(H7N9、H9N2,H2N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H11N2和H1N1),家禽和野禽间,不同亚型间,相同亚型不同分支间重配现象普遍,为新型流感病毒的产生提供了有利条件。从活禽市场分离的所有H5亚型病毒均为高致病性毒株,四株H7N9病毒和所有H9N2病毒对人类受体具有结合能力,但尚未完全适应感染哺乳动物。所有的H7,H9和H5亚型毒株在NA茎部中都有不同程度的缺失。所有H9N2病毒对神经氨酸酶抑制剂具有耐药性。两株H5N1病毒与所有H5N2,H1N1,H7N9和H9N2病毒在其M2蛋白发生S31N位点突变,具有金刚烷胺耐药性。同期开展的职业暴露人群血清流行病学队列研究中,2013年7月基线调查共纳入1995人,其中禽暴露组511人,猪暴露组569人和对照组950人,由于职业暴露工人流动性大,三年随访中不断有人员失访和新纳入。禽暴露组,猪暴露组和对照组累计有964,1079和1545名不同的研究对象参与队列研究,共采集2070,2026,3436人次血清。禽职业暴露者对H7N9,H9N2,H5N1的抗体阳性率(0.93%,1.87%,1.87%)比猪职业暴露者(0.19%,0.28%,0)和对照组(0.26%,0.58%,0)高,存在显著性差异(P=0.01,P0.001,P0.001)。而禽暴露组研究期间H7N9抗体阳性率基本稳定在0.5%的水平,H9N2抗体阳性率则由最初的0.2%上升至2%左右。仅从禽职业暴露人员中发现H5N1抗体阳性的研究对象,基线时H5N1抗体阳性率(0.20%)较低,随访第3年增长为3.46%。所有研究对象均未发现H5N6抗体阳性者。研究队列中分别有3,20,7位研究对象的H7N9、H9N2和H5N1病毒存在微量中和抗体滴度4倍升高的阳转现象。H7N9病毒在禽暴露组中的血清阳转率为0.43%,猪暴露组为0%,对照组为0.1%;而H9N2病毒在禽暴露者组中观察到相对较高的血清阳转率(2.78%),在猪暴露者和对照组中则分别为0.58%和0.39%;H5N1病毒抗体只在1.5%的禽暴露工人中出现阳转;所有研究对象中没有观察到关于H5N6病毒抗体阳转的现象。在禽职业暴露者中,H7N9病毒感染密度(1.27/1000人年)显着低于H9N2病毒(8.28/1000人年,P0.001)和H5N1病毒(4.46/1000人年,P=0.04)。调整性别和年龄分组后,禽职业暴露组相比于对照组,对H7N9病毒感染无显著性的差异,但更可能发生H9N2(调整后IRR=5.98,95%CI:1.91-18.65)和H5N1(P0.001)病毒感染。禽职业暴露者中不同暴露方式,接触不同动物和性别的感染风险不同。销售人员感染H9N2风险最高(调整OR=4.25;95%CI,1.20-25.32),接触鸽子相比于接触鸡(调整OR=3.13;95%CI,1.23-8.00),女性比男性(调整OR=5.48;95%CI,2.38-12.62)发生H5N1感染的可能更大。对照组中H9N2抗体滴度阳性或阳转的危险因素有性别(调整OR=8.75;95%CI,1.09-70.45)和慢性呼吸道疾病(调整OR=7.24;95%CI,1.42-37.00)。五、研究结论(1)从哨点动物SPF鸡中分离到新重组的H7N2和H5N6病毒,证明禽流感病毒可以在自然条件下由野生鸟类传播给家禽,并可能通过基因重配产生新型流感病毒;(2)禽养殖场和活禽市场中普遍存在AIVs的感染流行,以低致病性H9N2病毒为主,且活禽市场中检测阳性率高于养殖场。活禽市场中AIVs感染情况复杂,至少存在10种不同亚型AIVs流行,家禽和野禽间,不同亚型间,相同亚型不同分支内部基因间重配现象普遍。(3)职业暴露人群中可能存在H7N9、H9N2和H5N1的隐性感染,但抗体阳性率和阳转率均在较低水平,未发现H5N6隐性感染。(4)禽暴露人群相比猪暴露人群和一般人群,H7N9、H9N2和H5N1病毒的感染率更高。禽流感感染人类方式主要以禽-人接触的方式为主。(5)销售工作中接触禽(鸽子),性别和患有慢性呼吸道疾病是H9N2和H5N1感染的危险因素;禽暴露组相比于对照组,更易于感染H9N2和H5N1病毒,是今后禽流感预防控制的重点关注人群。六、意义和创新性通过开展哨点动物SPF鸡感染禽流感病毒的监测,证实自然条件下禽流感病毒由野鸟传播给家禽的假设。无锡市活禽市场中至少存在10种不同亚型禽流感病毒,病毒重配现象普遍。通过职业暴露人群禽流感病毒感染的血清流行病学调查,发现禽暴露组相比猪暴露组和对照组,H7N9、H9N2和H5N1病毒的感染率更高。禽职业暴露者中可能存在H7N9、H9N2和H5N1的隐性感染,未发现H5N6隐性感染,猪职业暴露者和一般人群中存在个别H7N9以及H9N2隐性感染。职业接触家禽会增加感染禽流感病毒的风险,禽职业暴露人群相比于一般人群,更易于感染H9N2和H5N1病毒,是禽流感防控的重点人员。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R511.7
【图文】：

地点,监测研究,病毒病,圆点

军事科学院博士学位论文1.1.2 监测地点2014 年 1 月至 10 月期间，选取江苏省无锡市太湖湖畔（北纬30°55′40″ 31°32′58″，东经 119°52′32″ 120°36′10″）作为 SPF 哨点鸡在自然状态下感染禽流感病毒的监测地点（图 1.1）。太湖是中国第三大淡水湖，面积约 2338平方公里，位于长江三角洲地区，是 40 种候鸟和 19 种留鸟的栖息地，位于候鸟迁徙路线上，是流感发生热点地区。具体位置位于无锡市境内太湖湖畔马山山脚处一块平整的土地，露天设置，约 100 平米空间可供哨点鸡自由活动。

系统发育树,动物,病毒,分支

基于 HA 基因的系统发育分析表明，两株 H7N2 病毒与在中国大陆地区造成H7N9 第一波和第二波大流行中得到的分离株密切相关，但却与第二波从江苏，浙江和江西分离到H7N9病毒处于另一个独立的分支（稳定性检验为99%（）图1.2A）。复合感染的两株 H9N2 病毒 HA 基因与 A/chicken/Jiangsu/DD6/2013(H9N2)最为接近（图 1.2C）。NA 基因片段与中国广泛流行的 H9N2 病毒和本研究中分离的 H9N2病毒（图 1.2）处于同一分支，与 2013 年中国江苏省家鸡的 H9N2 禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/WX0204/2013(H9N2)高度同源（图 1.2B）。而其他 6 个内部基因片段也全部源自我国广泛分布的 H9N2 病毒（图 1.3 ），与A/chicken/Qingdao/2144/2013(H9N2) ， A/chicken/Shandong/qd0917/2013(H9N2) ，A/chicken/Beijing/0339/2013(H9N2)，A/chicken/Shandong/0613/2012(H9N2)等最为接近。以上结果表明两株 H7N2 流感病毒是由近期在中国流行的 H7N9 和 H9N2病毒的重配而来。

谱系,系统发育树,病毒,动物

军事科学院博士学位论文1.2.3 H5N6 病毒系统发育分析对于本研究分离到的 H5N6 病毒，HA 基因系统发育分析表明该病毒与属于进化枝 2.3.4.4 的广东省 A/chicken/Dongguan/4259/2013（H5N6）最为接近，可能来源于 2010 年以来在中国家禽中检测到的 HXN1，HXN2和 HXN8型高致病性 H5 禽流感病毒以及 2014 年在越南检测到的病毒。 H5N6 病毒的 NA 基因片段属于江西谱系，可能来源于中国福建和广东省流行的 H6N6 禽流感病毒，与A/chicken/Dongguan/3363/2013（H5N6）最为接近（图 1.4）。该 H5N6 病毒的六个内部基因与 2013 年至 2014 年间我国广东鸡鸭分离到的 H5N6 病毒相应片段接近，与病人分离的 A/Yunnan/1027/2015（H5N6）处于不同分支（图 1.5）。

【参考文献】